杜娟，路義鑫，陳景濤

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

雞屎藤抗雞傳染性支氣管炎病毒的體外活性初步研究

杜娟1，2，路義鑫1，陳景濤2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

現(xiàn)代研究表明雞屎藤具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等作用，對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、肺炎雙球菌有抑制作用。本文選用雞胚成纖維細(xì)胞，采用傳染性支氣管病毒進(jìn)行侵染，對半數(shù)細(xì)胞感染量進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雞屎藤提取液對體外傳染性支氣管病毒具有一定的抑制作用。

雞屎藤，雞傳染性支氣管炎，雞胚成纖維細(xì)胞

雞屎藤，又稱雞矢藤，為茜草科雞屎藤屬草本植物，廣泛分布于我國的陜西、甘肅、山東、江蘇、安徽、湖南、湖北、廣東、貴州等地區(qū)。雞屎藤中含有多種糖苷、黃酮、生物堿及揮發(fā)油成分，具有鎮(zhèn)痛消炎，抗氧化等功效，其新鮮枝葉被用于熬湯、禽畜飼料添補(bǔ)劑及其他食品加工中。目前，關(guān)于雞屎藤抗炎抗病毒等藥理活性已有報(bào)道，但未見雞屎藤對肉雞傳染性支氣管炎病毒的體外活性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品雞屎藤，于2015年9月采自中國科學(xué)院廣州華南植物園。1kg藥材加10倍量水煎1h，減壓抽濾。藥渣加5倍量水再煎1h抽濾，合并兩次濾液減壓濃縮至500mL，加95%乙醇至終濃度75%，4℃靜置過夜。離心取上清，調(diào)pH值至7.2～7.4，120℃高壓滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆?。利巴韋林，購于國藥集團(tuán)榮生制藥有限公司，批號20150216。

1.1.2 雞胚9d SPF雞胚，購于中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)毒株傳染性支氣管炎病毒（IBV）標(biāo)準(zhǔn)株Mass41由中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室自行傳代保存。

1.2 方法

1.2.1 傳染性支氣管炎病毒的增殖尿囊腔法接種病毒：取出活雞胚，傳染性支氣管炎病毒IBV M41標(biāo)準(zhǔn)株按1:10稀釋后種毒，每個(gè)雞胚接種0.2mL病毒液。孵育48h后將雞胚置于4℃過夜處死。次日，取處死的雞胚，于超凈工作臺(tái)內(nèi)用碘酒和75%乙醇消毒，用無菌注射器吸取尿囊液并離心10 min、3000rpm，取上清合并后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）的制備取9d SPF雛雞于超凈工作臺(tái)中用碘酒和75%乙醇消毒，打開氣室后將雞胚取出置于無菌培養(yǎng)皿中，分離頭部，四肢和內(nèi)臟，剪成1mm3左右小塊，用PBS溶液洗3遍后加5～6倍量0.25%胰酶37℃消化15min，加入細(xì)胞生長液終止消化并離心5min，1000rpm。棄上清，沉淀部分用PBS洗3次并吹打均勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至2×106個(gè)/mL，100μL/孔的細(xì)胞量滴入96孔板內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)備用。

1.2.3 IBV半數(shù)細(xì)胞感染量測定（TCID50）取IBV尿囊液，10倍等度稀釋，加入長滿單層CEF的96孔板，測得IBV對CEF的半數(shù)細(xì)胞感染量（TCID50）為10-5，因此，使用時(shí)將IBV尿囊液稀釋100倍至終濃度103TCID50。

1.2.4 雞屎藤提取液對雞胚成纖維細(xì)胞最大安全濃度的測定用細(xì)胞維持液分別將雞屎藤提取液和利巴韋林稀釋為16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.50mg/mL及2.56、1.28、0.64、0.32、0.16、0.08mg/mL。取單層CEF的96孔板棄培養(yǎng)液后分別加入各濃度的雞屎藤提取液及利巴韋林，每濃度重復(fù)6孔，每孔100μL。置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每24h記錄并用MTT法測各孔490nm波長的OD值。

1.2.5 雞屎藤提取液體外抗IBV試驗(yàn)根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)測出雞屎藤提取液和利巴韋林的最大安全濃度分別為4.0mg/mL及0.16mg/mL。取長至單層的CEF細(xì)胞進(jìn)行如下分組：A組：預(yù)防組，CEF接種IBV前24h分別加入用細(xì)胞維持液稀釋為4.0、2.0、1.0、0.50、0.25、0.125mg/mL的雞屎藤提取液，每濃度做6個(gè)重復(fù)，每孔加100μL。置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后每孔加入100μL 103TCID50的病毒液。B組：治療組，取CEF細(xì)胞加入IBV后培養(yǎng)6h，分別加入雞屎藤提取液4.0、2.0、1.0、0.50、0.25、0.125mg/mL，每個(gè)濃度做6個(gè)重復(fù)，每孔加100μL。C組：雞屎藤提取液與利巴韋林同時(shí)加入組，在CEF細(xì)胞中同時(shí)加入利巴韋林及細(xì)胞維持液稀釋為4.0、2.0、1.0、0.50、0.25、0.125mg/mL的雞屎藤提取液，每個(gè)濃度做6個(gè)重復(fù)，每孔加100μL。以上均設(shè)空白對照組（僅細(xì)胞維持液）、陰性對照組（細(xì)胞維持液和103TCID50病毒液）、陽性對照組（利巴韋林和103TCID50病毒液）、無細(xì)胞調(diào)零孔（僅加細(xì)胞維持液）。所有分組均放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h后記錄并用MTT法測490nm波長下OD值。

2 結(jié)果

2.1 雞屎藤提取液對細(xì)胞的安全濃度

表1 不同濃度雞屎藤提取液和利巴韋林對CEF細(xì)胞的OD值影響（=±s，n=6）

表1 不同濃度雞屎藤提取液和利巴韋林對CEF細(xì)胞的OD值影響（=±s，n=6）

注：與空白對照組比較，**p＜0.01，*p＜0.05。

由表1可知：雞屎藤提取液濃度為4.0mg/mL的OD值與空白對照組的OD值無顯著性差異，初步確定4.0mg/mL為雞屎藤提取液最大安全濃度。利巴韋林濃度為0.16mg/mL是與空白對照組無顯著性差異，故利巴韋林的最大安全濃度為0.16mg/mL。

2.2 雞屎藤提取液體外抗IBV試驗(yàn)#P＜0.05。

表2 雞屎藤提取液體外抗IBV實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞OD值（=±s，n=6）

表2 雞屎藤提取液體外抗IBV實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞OD值（=±s，n=6）

注：與空白對照組相比～～p＜0.01，～p＜0.05；與陰性對照組相比**p＜0.01，*p＜0.05；與陽性對照組相比##p＜0.01，

由表2可知：在預(yù)防組，治療組和同時(shí)作用組實(shí)驗(yàn)中，雞屎藤提取液濃度為0.4、0.2、0.1、0.5、0.25、0.125時(shí)的OD值均明顯高于IBV感染細(xì)胞的OD值（p＜0.05），高濃度（4.0 mg/mL）時(shí)，抗IBV活性與陽性藥利巴韋林活性相當(dāng)，因此雞屎藤提取液有明顯的抗IBV感染作用；同時(shí)，先給雞屎藤提取液后再感染IBV以及兩種同時(shí)給藥時(shí)的OD值要高于IBV感染后再給藥的OD值，據(jù)此可初步推測雞屎藤提取液對雞傳染性支氣管炎病毒IBV的預(yù)防作用更占主導(dǎo)。

3 結(jié)論與討論

雞屎藤作為我國傳統(tǒng)中草藥，有鎮(zhèn)痛、解毒、消炎等藥效作用，臨床療效顯著，安全且毒副作用較少。在我國南方部分地區(qū)有將雞屎藤用于禽畜飼料添加劑的傳統(tǒng)，而本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果初步驗(yàn)證了雞屎藤提取液對雞傳染性支氣管炎病毒的拮抗預(yù)防作用，為雞屎藤作為禽畜飼料補(bǔ)充劑的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．05.013