羅 寧，楊娟娟，郭 靜，陳 麗，程忠平

(1.同濟大學附屬楊浦醫(yī)院婦產(chǎn)科 同濟大學醫(yī)學院婦科微創(chuàng)醫(yī)學研究所，上海 200090；2.蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院，江蘇 蘇州 215200)

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沉默肌瘤基質(zhì)成纖維細胞FAP基因可抑制雌激素的細胞增殖效應(yīng)

羅 寧1，楊娟娟2，郭 靜1，陳 麗1，程忠平1

(1.同濟大學附屬楊浦醫(yī)院婦產(chǎn)科 同濟大學醫(yī)學院婦科微創(chuàng)醫(yī)學研究所，上海 200090；2.蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院，江蘇 蘇州 215200)

目的 觀察成纖維細胞活化蛋白(FAP)表達在雌激素對子宮肌瘤基質(zhì)成纖維細胞的活化和促增殖中的作用。方法 采用免疫磁珠法分離成纖維細胞并檢測雌激素受體(ER-α/ER-β)表達情況。以雌激素分別刺激子宮正常平滑肌基質(zhì)成纖維細胞及子宮肌瘤基質(zhì)成纖維細胞(TAF)，并檢測FAP、細胞外基質(zhì)(ECM)、生長因子的分泌情況和細胞增殖活力的改變，以及檢測細胞增殖通路相關(guān)信號分子的改變；使用RNAi技術(shù)沉默TAF的FAP基因，觀察雌激素刺激對TAF上述指標表達水平的影響。結(jié)果 TAF的FAP、ER-α/ER-β的表達水平高于成纖維細胞(n=10，P<0.05)。經(jīng)雌激素刺激，成纖維細胞和TAF的 FAP、ECM(Fibronectin、Laminin、Collgen I)和生長因子(TGF-β、IGF-1)表達水平，細胞增殖活力、細胞增殖通路相關(guān)信號分子(AKT、ERK、c-Fos、MEK)的磷酸化水平均上調(diào)；RNAi沉默F(xiàn)AP基因可抑制雌激素介導(dǎo)的上述生物學作用。結(jié)論 FAP基因表達是E2活化及促進子宮肌瘤基質(zhì)成纖維細胞增殖過程中的關(guān)鍵，其可能在子宮肌瘤發(fā)病機制中具有重要作用并且可能成為治療子宮肌瘤的新靶點。

子宮肌瘤；成纖維細胞；腫瘤相關(guān)成纖維細胞；雌激素；成纖維細胞活化蛋白

子宮肌瘤是女性生殖系統(tǒng)最常見的良性腫瘤，常見的臨床表現(xiàn)為子宮異常出血，腹部腫塊及壓迫癥狀，不孕與流產(chǎn)等，嚴重影響女性健康[1]。子宮肌瘤生長表現(xiàn)為激素依賴性，雌激素在子宮肌瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中有重要作用[2-3]。

有研究表明，腫瘤微環(huán)境為腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展提供了一個良好的環(huán)境，成纖維細胞是腫瘤微環(huán)境中最主要的基質(zhì)細胞[4]。不同于正常組織中的成纖維細胞，腫瘤組織中的成纖維細胞約有80%處于持續(xù)活化狀態(tài)，也稱為腫瘤相關(guān)成纖維細胞(tumor association fibroblasts，TAF)[5]?；罨某衫w維細胞特征性改變表現(xiàn)為表達成纖維細胞活化蛋白(fibroblasts activation protein，F(xiàn)AP)。FAP不僅是成纖維細胞活化后特異表達的標記物，還參與了腫瘤生長的調(diào)控[6]。因此，F(xiàn)AP有望成為抗腫瘤藥物研究的靶點。

目前，成纖維細胞與子宮肌瘤發(fā)生的關(guān)系存在諸多未知，雌激素促子宮肌瘤發(fā)生的作用機制也有待進一步探究。本研究分離子宮肌瘤組織中的成纖維細胞，觀察其活化水平；采用雌激素刺激，比較刺激前后成纖維細胞活化、增殖活力的改變及細胞增殖通路信號分子的表達情況，同時采用RNAi干擾技術(shù)抑制FAP基因表達，觀察雌激素對FAP基因抑制后TAF的活化效應(yīng)。通過多種生物學技術(shù)方法，探索雌激素對子宮基質(zhì)成纖維細胞的活化作用及FAP表達在雌激素對肌瘤基質(zhì)成纖維細胞的活化和促增殖中的作用。

1材料與方法

1.1材料

選擇因子宮肌瘤需行子宮切除術(shù)患者10例，排除子宮肉瘤、多囊卵巢綜合征等婦科腫瘤及內(nèi)分泌疾病，術(shù)前6個月無使用激素類藥物治療史，術(shù)后病理證實為子宮肌瘤。取患者子宮肌瘤和子宮平滑肌組織各5g。

1.2原代細胞分離及培養(yǎng)

取子宮平滑肌和子宮肌瘤組織(各約2g)分別置于加雙抗(青霉素：1 000IU/mL，鏈霉素：1 000μg/mL)的漢克斯平衡鹽溶液(Hanks balanced salt solution，HBSS)里轉(zhuǎn)移至實驗室；取適量平滑肌和肌瘤組織(各約2g)分別進行下述處理：用眼科剪剪碎后加0.4%混合膠原酶8～10mL(含20μg/mL DNaseⅠ)、0.05%胰酶2mL，37℃搖床消化2～3h，過單細胞濾網(wǎng)(30μm)，去除死細胞(Dead Cell Removal Kit，#130-090-101)，細胞計數(shù)；離心(300g)10min，棄上清液，重懸每107細胞于80μL緩沖液；每107細胞加20μL結(jié)合抗成纖維細胞抗體的磁珠(#130-050-601)，室溫孵育30min；每107細胞加1～2mL緩沖液清洗，離心(300g)10min，棄上清液；重懸最多108細胞于500μL緩沖液，置于分選器磁場中的分選柱，收集未標記的細胞，將柱子轉(zhuǎn)移至收集試管，洗出標記的成纖維細胞。

1.3Western blot檢測

細胞收集后采用含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液裂解，4℃下離心(12 000g)15min，抽提蛋白，采用蛋白定量分析試劑盒(BCA)定量，儲存于-80℃。蛋白經(jīng)沸水煮5min，每孔加20μg蛋白，進行凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜，加入含3%牛血清白蛋白(BSA)的等滲鹽溶液(TBST)溶液室溫封閉60min，加入相應(yīng)一抗室溫孵育2h，洗滌后加入二抗室溫封閉1h，增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)法進行發(fā)光，采用ImageQuant LAS4000測定條帶測灰度值。

1.4細胞免疫熒光

細胞采用4%多聚福爾馬林室溫固定15min，磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次，加入封閉液(PBS，3% BSA，0.1% Triton-X 100)室溫封閉30min。加入一抗抗FAP抗體(1:200，ab28244，Abcam)/ ER-α抗體(1:100，ab9269，Abcam)，置濕盒內(nèi)，4℃過夜，細胞經(jīng)PBS洗滌后加入二抗(Alexa Fluor標記山羊抗兔抗體及FITC標記山羊抗鼠抗體)室溫孵育1h，PBS洗滌10min，熒光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.5實時定量-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)

采用SYBR Green I 熒光定量PCR檢測ER-α和ER-β的基因表達水平。采用Trizol從冰凍的組織中提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，ER-α上游引物：5′-TCCT￣GCCAGCTCATTTCCTTC-3′，反向引物：5′-TCACCTGGGTC￣ATTGGCTAAC-3′，ER-β上游引物：5′-GACA￣TGCTC￣CTGGCAACTAC-3′，反向引物：5′-ATGCCGCTCTTGGCAATC-3′，GAPDH 作為參照基因，上游引物:5′-GCACCGTC￣AAGGCTGAGAAC-3′，反向引物：5′-GCCTTCT￣CCATGGTGG￣TGAA-3′。將制備好的cDNA進行PCR擴增，擴增體系如下：50℃下變性2min，95℃下變性5min，95℃下變性15s和60℃下變性35s，循環(huán)40次。

1.6 MTT比色法檢測

成纖維細胞，正常平滑肌細胞(SMC)及肌瘤細胞(UFC)按5 000個/孔接種于96孔板，分別在24h、48h及72h時間節(jié)點進行MTT檢測。每組每孔加入20μL MTT溶液(0.5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔再加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值，計算增長速率。

1.7 RNA干擾

成熟的反義序列是5′-TTCTAGGATATTGTTCATCGC-3′，用慢病毒(載體或包含F(xiàn)AP shRNA的載體)感染成纖維細胞48h后，再分別培養(yǎng)48h、72h，檢測細胞的增殖活力、ECM(Fibronectin、Laminin、Collgen Ⅰ)、生長因子(TGF-β、IGF-1)及細胞增殖通路相關(guān)信號分子的表達。

1.8統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0軟件，組間分析采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1子宮肌瘤組織存在活化的成纖維細胞

Western blot檢測結(jié)果顯示CD90在TAF及成纖維細胞中表達較高，而在子宮肌瘤及周圍平滑肌組織中分離的平滑肌細胞中表達低，表明免疫磁珠法可分離得到純度高的成纖維細胞，可用于后續(xù)的研究，見圖1A。細胞免疫熒光及Western blot檢測結(jié)果均顯示，F(xiàn)AP在TAF中的表達強于成纖維細胞，表明TAF處于活化狀態(tài)(n=10，P<0.05)，見圖1B、圖1C。

注：A.采用結(jié)合有抗CD90的免疫磁珠分選成纖維細胞(10例)，并采用抗CD90抗體檢驗分離純度；B.western blot法檢測子宮平滑肌和肌瘤組織來源成纖維細胞FAP的表達水平；C.細胞免疫熒光法檢測子宮平滑肌和肌瘤組織來源成纖維細胞FAP的表達水平。

圖1 子宮肌瘤組織來源成纖維細胞處于活化狀態(tài)

Fig.1 Fibroblasts in activation state in uterine fibroid

2.2子宮肌瘤組織中活化成纖維細胞的雌激素受體表達增加

細胞免疫熒光、western-blot和PCR法檢測結(jié)果顯示，正常平滑肌組織成纖維細胞和子宮肌瘤TAF均表達ER-α和ER-β，且TAF ER-α、ER-β的表達高于平滑肌組織來源成纖維細胞)，表明雌激素能作用于子宮肌瘤TAF及平滑肌組織來源成纖維細胞(n=10，P<0.05)，見圖2。

注：A.子宮肌瘤TAF及平滑肌組織來源成纖維細胞ER-α、ER-β的表達水平;B.Western blot檢測子宮肌瘤TAF及平滑肌組織來源成纖維細胞的雌激素受體表達水平。C.細胞免疫熒光檢測子宮肌瘤TAF及平滑肌組織來源成纖維細胞的ER-α、ER-β表達水平。

圖2 兩種組織來源成纖維細胞雌激素受體的表達

Fig.2 Expressions of estrogen receptors in fibroblasts from two kinds of tissues

2.3雌激素促進成纖維細胞的增殖

選擇雌激素作用的兩個有效濃度(10ng/mL、50ng/mL)，外加雌激素至培養(yǎng)的成纖維細胞及TAF，采用MTT法檢測成纖維細胞及TAF的增殖能力，實驗結(jié)果顯示：經(jīng)雌激素刺激48h、72h后，成纖維細胞及TAF的增殖活力顯著增強(n=5，P<0.05)，見圖3。表明，雌激素能增強成纖維細胞及TAF的增殖活力。

注：A.成纖維細胞的增殖活力；B.TAF的增殖活力。

圖3 雌激素能增強成纖維細胞的增殖活力

Fig. 3 Effect of estrogen on proliferation of Fib and TAF cell.

2.4雌激素能激活成纖維細胞增殖信號通路、促進生長因子及ECM的分泌

Western blot檢測了雌激素刺激成纖維細胞后，細胞增殖信號通路相關(guān)分子表達的改變。結(jié)果顯示雌激素能促進成纖維細胞及TAF細胞的增殖信號通路分子MEK、ERK1/2及AKT的磷酸化水平，且在50nM濃度的作用較為顯著，見圖4。ELISA法檢測雌激素分別刺激成纖維細胞及TAF后，TAF及成纖維細胞的TGF-β、IGF-1的分泌量均顯著增加(n=5，P<0.05)，見圖5A、圖5B。western-blot檢測顯示在雌激素的作用下，成纖維細胞及TAF的FAP、ECM，如CollgenⅠ，F(xiàn)ibronectin、Laminin表達強度高(n=5，P<0.05)，見圖5C、圖5D，上述結(jié)果提示雌激素能刺激成纖維細胞活化，釋放生長因子并促進ECM的表達。

圖4 雌激素能激活成纖維細胞增殖信號通路

Fig.4 Effect of estrogen on activating cell proliferation pathway

注：A.成纖維細胞及TAF的TGF-β的表達水平。B.成纖維細胞及TAF的IGF-1表達水平；C.成纖維細胞及TAF的Collagen1表達水平；D.成纖維細胞及TAF的FAP、Fibronectin及Laminin表達水平。

圖5 雌激素能促進成纖維細胞分泌生長因子及ECM成分

Fig.5 Effect of estrogen on promoting secretion of growth factor and ECM in fibroblast

2.5沉默F(xiàn)AP的表達能抑制Fib活化及細胞增殖通路

采用RNAi的方法，抑制FAP的表達，在此基礎(chǔ)上用雌激素對成纖維細胞進行刺激，結(jié)果顯示，成纖維細胞在FAP抑制后，細胞的增殖活性下降，活化水平不如非抑制狀態(tài)下顯著，但未完全阻斷，因此結(jié)果提示雌激素是部分通過FAP途徑來活化成纖維細胞的，見圖6A。且FAP經(jīng)抑制表達后，細胞增殖信號通路分子的磷酸化部分下降，表明FAP在細胞增殖信號通路活化中的促進作用，見圖6B。成纖維細胞ECM成分(Fibronectin、Laminin、Collgen Ⅰ)的表達水平亦下降，表明FAP也影響雌激素介導(dǎo)的ECM活化通路(n=5，P<0.05)，見圖6C。

注：A.TAF的增殖活力;B.細胞增殖通路信號分子AKT, MEK, ERK1/2及c-FOS的磷酸化水平;C. TAF的Fibronectin及Laminin的表達水平。

圖6 沉默F(xiàn)AP基因表達能抑制成纖維細胞活化及其細胞增殖通路

Fig.6 Effect of silencing FAP gene on prohibiting fibroblast activation and its proliferation pathway

3討論

3.1成纖維細胞活化蛋白表達對雌激素調(diào)控的影響

FAP屬于絲氨酸蛋白酶家族，能通過降解ECM、抑制免疫系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)及激活細胞信號通路，促進腫瘤的生長。但目前為止，F(xiàn)AP在子宮肌瘤中的調(diào)控尚未見有相關(guān)研究。雌激素在子宮肌瘤的發(fā)病過程中具有重要作用；多種生長因子，如vEGF、TGF-β、bFGF、IGF-1、EFG也被證實參與了子宮肌瘤的發(fā)病。近來有研究表明，肌瘤細胞、成纖維細胞及其之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能也參與了子宮肌瘤的發(fā)病過程[7]。然而到目前為止，關(guān)于子宮肌瘤基質(zhì)成纖維細胞的活化情況、活化因素及活化的成纖維細胞的生物學功能尚缺乏研究。本課題對子宮肌瘤與正常平滑肌組織中成纖維細胞純化分離并進行研究，檢測了子宮肌瘤組織來源成纖維細胞的活化水平并驗證了其生物學活性，同時探索了FAP表達對雌激素調(diào)控子宮正常平滑肌組織與肌瘤組織成纖維細胞增殖效應(yīng)的影響。

3.2成纖維細胞的活化程度顯著高正常子宮平滑肌組織

TAF主要來自組織中成纖維細胞的活化，TAF的標記蛋白包括α-SMA、FAP、成纖維細胞特異蛋白1(fibroblast specific protein 1，F(xiàn)SP1)等[8]。FAP特異表達于組織損傷愈合過程及90%以上的上皮惡性腫瘤的基質(zhì)成纖維細胞中，包括結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌，在正常組織成纖維細胞中通常不表達，可作為一個確定的成纖維細胞激活表型的標記物[9]。本文研究發(fā)現(xiàn)，TAF FAP的表達水平明顯高于成纖維細胞。結(jié)果表明，子宮肌瘤組織中成纖維細胞的活化程度顯著高正常子宮平滑肌組織。

鑒于活化的成纖維細胞在腫瘤發(fā)病過程中的重要作用及雌激素在子宮肌瘤發(fā)病機制中的作用，進一步驗證了雌激素對成纖維細胞的活化作用。眾所周知，雌激素主要通過ER介導(dǎo)發(fā)揮生物學效應(yīng)。到目前為止，尚未有關(guān)于子宮肌瘤基質(zhì)成纖維細胞ER的表達情況的研究。本課題通過免疫磁珠法分別分離出子宮正常平滑肌組織和子宮肌瘤組織中的成纖維細胞，并檢測ER的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TAF及Fib均表達雌激素受體(ER-α、ER-β)，且在TAF上的表達水平明顯高于Fib，提示TAF較Fib對雌激素刺激可能具有更高的敏感性。然而，經(jīng)過雌激素刺激，肌瘤與平滑肌組織來源成纖維細胞究竟會有什么樣的生物學行為改變，及其可能在子宮肌瘤生發(fā)過程中的作用，目前也未見有文獻報道。為此，本研究采用雌激素刺激TAF及Fib，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)雌激素刺激后，TAF及Fib的增殖活力較刺激前增強；FAP、ECM成分(Collagen I、Fibronectin、Laminin)、生長因子(TGF-β、IGF-1)的表達水平均發(fā)生顯著上調(diào)，且表現(xiàn)為濃度依賴性；此外，兩種組織來源成纖維細胞的增殖通路信號分子(p-AKT，p-MEK，p-ERK及p-c-Fos)的磷酸化水平也上調(diào)；提示雌激素能活化兩種組織來源的成纖維細胞，并促進其分泌ECM成分、細胞因子及增殖活力的增強。

3.3成纖維細胞活化蛋白參與了腫瘤生長的調(diào)控

FAP不僅是成纖維細胞活化后特異表達的標記物，研究表明，F(xiàn)AP還參與了腫瘤生長的調(diào)控。FAP屬于絲氨酸蛋白酶家族，能降解脯氨酸與其他氨基酸之間的肽鍵，同時FAP還具有內(nèi)肽酶活性使其具有降解明膠、I型膠原蛋白的能力，重塑ECM，促進細胞的侵襲能力[10]，F(xiàn)AP陽性細胞具有免疫抑制能力，能夠抑制免疫系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)[11-12]，此外，有研究還表明，除了酶活性外FAP還具有激活細胞信號通路的能力，也能促進腫瘤的生長[13-14]。但目前為止，F(xiàn)AP在子宮肌瘤中的調(diào)控尚未見有研究。本課題采用RNAi特異沉默TAF中FAP基因的表達，進一步觀察抑制FAP表達對成纖維細胞活化及增殖調(diào)控相關(guān)事件的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TAF的FAP被抑制后，雌激素介導(dǎo)的促TAF分泌 ECM成分、生長因子(TGF-β、IGF-1)及增強TAF的增殖活力的作用被抑制，細胞增殖通路上的相關(guān)信號分子(AKT、ERK、c-Fos、 MEK)的磷酸化水平也顯著降低。以上結(jié)果表明，F(xiàn)AP在雌激素促成纖維細胞活化的過程中具有重要作用。

本課題對子宮肌瘤成纖維細胞進行了獨立研究，證明成纖維細胞在子宮肌瘤中處于活化狀態(tài)，雌激素能活化成纖維細胞，活化的成纖維細胞能夠分泌TGF-β，通過自分泌和(或)旁分泌途徑，放大活化效應(yīng)，介導(dǎo)成纖維細胞增殖效應(yīng)，而沉默F(xiàn)AP基因表達后則能抑制活化的成纖維細胞的上述生物學作用。本課題結(jié)果提示：基質(zhì)成纖維細胞活化在子宮肌瘤發(fā)病中具有重要作用；FAP在成纖維細胞促細胞增殖效應(yīng)中具有關(guān)鍵作用，可能成為今后的治療靶點。

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[專業(yè)責任編輯：呂淑蘭]

Inhibiting estrogen-mediated cell proliferation effect by silencing the expression of fibroblast cell FAP gene

LUO Ning1, YANG Juan-juan2, GUO Jing1, CHEN Li1, CHENG Zhong-ping1

(1. Department of Obstetrics and Gynecology, Yangpu Hospital Affiliated to Tongji University,Minimally Invasive Gynecology Lab, Medical College of Tongji University, Shanghai 200090, China;2.The First People’s Hospital of Wujiang District, Jiangsu Suzhou 215200, China)

Objective To explore the effect of fibroblast activation protein (FAP) expression on the estrogen-mediated activation and proliferation of uterine leiomyoma fibroblast cell. Methods Fibroblast cells from uterine smooth muscle (fib) and uterine leiomyoma or tumor associated fibroblast (TAF) were separated using immunomagnetic beads, and the expression of estrogen receptor (ER-α/ER-β) was measured. Normal uterine smooth muscle fibroblast and uterine lieomyoma fibroblast or tumor associated fibroblast (TAF) were stimulated with estrogen, and the changes of FAP, extracellular matrix (ECM), growth factor secretion, cell proliferation activity and signal molecular of cell proliferation pathway were measured. The expression of FAP gene in TAF was silenced by RNA interference and the influence of estrogen on expressions of the above TAF markers was analyzed. Results The expression levels of FAP and ER-α/ER-β in TAF were higher than those in fibroblast (n=10,P<0.05). After E2stimulation, the expressions of FAP, ECM(Fibronectin, Laminin, Collgen I)and growth factor(TGF-β, IGF-1), proliferation activity and phosphorylation level of signal molecular of cell proliferation pathway(AKT, ERK, c-Fos, MEK)increased . Silencing FAP expression with RNA interference could inhibit the E2-mediated biological effects. Conclusion FAP expression is the key to the E2-mediated activation and proliferation of fibroblast cells, which hints that FAP may play an important role in the pathogenesis of uterine leiomyoma, and can be targeted in future for the treatment of uterine leiomyoma.

uterine fibroid; fibroblast; tumor association fibroblast (TAF); estrogen; fibroblast activation protein (FAP)

2015-05-25

羅 寧(1986-)，男，住院醫(yī)師，碩士研究生，主要從事婦科微創(chuàng)技術(shù)、子宮肌瘤的研究。

程忠平，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.10.015

R737.33

A

1673-5293(2016)10-1210-05