李煥斌 熊愛輝 （湖南省邵陽市新寧縣一渡水鎮(zhèn)動物防疫站 422714)

豬口蹄疫O型滅活疫苗制苗毒株的篩選

李煥斌 熊愛輝 （湖南省邵陽市新寧縣一渡水鎮(zhèn)動物防疫站 422714)

目前我國豬群中主要流行O型口蹄疫病毒，分屬于古典中國 （Cathay)拓撲型、中東-南亞 （ME-SA)拓撲型、東南亞 （SEA)拓撲型。長期以來，豬群中一直以Cathay拓撲型占優(yōu)勢，經(jīng)過多年的遺傳演化，進一步可以分為老毒株和新型毒株。在豬群中不時有中東南亞拓撲型的泛亞毒株流行。2010年前后由于新毒株侵入，又有東南亞拓撲型的緬甸-98型毒株流行。選擇從臨床發(fā)病豬最新分離鑒定的病毒材料12株，經(jīng)綜合分析后篩選發(fā)現(xiàn)O/HB/07/4、O/GX/09/7、O/XJ/10-11 3個毒株對豬毒力強，對BHK-21細胞具有良好的適應性，免疫原性好，生物學特性符合疫苗毒株的要求，但其單苗免疫覆蓋面有限，需要進一步進行組合制備免疫覆蓋面廣的新型疫苗。

豬口蹄疫；滅活疫苗；疫苗毒株；免疫

我國豬口蹄疫主要是O型口蹄疫，偶爾也感染亞洲I型和A型口蹄疫。從20世紀60年代中期開始，O型豬口蹄疫發(fā)病逐漸上升，主要流行毒株為古典中國 （Cathay）拓撲型病毒，經(jīng)過50年的流行，該譜系病毒的感染發(fā)病率發(fā)生明顯變化，出現(xiàn)了所謂老毒株、變異毒株和新變異毒株，病毒的變異使得其致病力越來越強，防控難度越來越大[1]。使口蹄疫疫情更加復雜和嚴重的是1999年泛亞毒株侵入我國，該毒株初期主要感染牛群，經(jīng)過10多年在豬群中的變異，出現(xiàn)了泛亞豬體適應毒株，該毒株致病力強，曾造成南方數(shù)省豬只死亡。近年來，特別是2010年，由于新型的緬甸-98毒株侵入我國，該毒株對豬群、牛群感染力均很強，造成了重大損失。目前我國豬群中，流行的O型口蹄疫有3個拓撲型，多個譜系病毒共存的復雜局面[2]。

我國采取以免疫為主的綜合防控措施，20世紀60年代，曾使用弱毒疫苗防疫，80年代研制出了第1代滅活疫苗。雖然推出不少種類的疫苗，但面臨豬口蹄疫病毒流行復雜的局面，須對豬群中未來可能流行的口蹄疫病毒進行1次綜合評價，篩選出免疫普廣的疫苗毒株。

本研究將通過綜合分析我國豬群中流行的主要病毒株，研究高效、廣譜的新型疫苗以覆蓋目前國內(nèi)豬群中主要流行毒株為目標。選擇免疫原性好、抗原普廣、對試驗動物及本動物致病力強、毒力穩(wěn)定，以及對研制疫苗材料具有良好適應性的制苗種毒，是疫苗研制和免疫成敗的關鍵。本試驗將從臨床發(fā)病豬分離鑒定的12株病毒材料分別進行VP1核苷酸序列測定、乳鼠適應性及毒力測定、細胞適應性及毒力比較、試驗室細胞傳代和生產(chǎn)用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)特性比較和毒力測定，部分毒株對豬感染性測定、抗原關系分析、免疫普及免疫原性測定，篩選符合制苗毒株要求的候選制苗毒株。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

乳鼠：為疾病預防控制中心引進的SPF3日齡乳鼠。

豬：仔豬和健康長白豬均為購自非口蹄疫疫區(qū)，未曾免疫過口蹄疫O型滅活疫苗，經(jīng)檢驗口蹄疫O型血清抗體為陰性 （乳鼠中和抗體效價＜1∶4， 或者細胞中和抗體效價＜1∶8，或者ELISA抗體效價＜1∶8和3ABC抗體檢測D值小于0.2）。交叉攻毒試驗用豬體重40kg左右，安全性檢驗用豬為30～40日齡。

1.2 細胞

為疾病預防控制中心引進的BHK-21細胞，傳代后凍存于液氮中；PK15細胞由疾病預防控制中心引進。

1.3 毒株的遺傳關系分析

將原始病毒材料和本研究傳代3代的病毒材料，按照常規(guī)RT-PCR方法進行擴增毒株的VP1基因，PCR產(chǎn)物直接測序，確認序列并確定基因型。同時與國內(nèi)外口蹄疫參考毒株進行比較，繪制系統(tǒng)發(fā)生樹。根據(jù)VP1基因核苷酸序列的同源性，分析毒株之間的遺傳學關系。

1.4 毒株主要生物學特性分析

1.4.1 病毒的乳鼠適應性研究

將國家口蹄疫參考試驗室提供的12株病毒乳鼠組織毒，分別按照1∶10比例加入MEM培養(yǎng)基研磨制成懸液，4℃浸潤過夜，2～3日齡昆明系小白鼠每只背部皮下注射0.2 mL，逐日觀察記錄乳鼠的發(fā)病死亡情況，棄掉10h內(nèi)死亡的乳鼠，收獲10h后瀕死或者死亡的乳鼠，去掉頭部、皮毛、爪子后，剪成小塊后加入磷酸甘油，于-70℃保存，同時如前步驟處理連續(xù)傳代使乳鼠發(fā)病死亡時間縮短穩(wěn)定在16～30h。記錄各毒株不同代次乳鼠發(fā)病、死亡時間。當傳代毒株穩(wěn)定后制備種子批，并測定其對乳鼠的半數(shù)死亡量，以此來評價對乳鼠的毒力[3]。

1.4.2 病毒的細胞適應性研究

對12株病毒的傳代乳鼠病毒進行BHK-21細胞適應試驗，病毒接種量為10%，培養(yǎng)時間為細胞出現(xiàn)病變?yōu)橹?，記錄具體時間，連續(xù)傳代使收毒時間穩(wěn)定在24h以內(nèi)。連續(xù)盲傳4代不能產(chǎn)生細胞病變的病毒，通過傳代PK15細胞和BHK-21細胞交叉?zhèn)鞔姆椒ㄟM行，接毒量為10%，細胞病變達到90%以上時收獲病毒。

1.5 對豬致病性的研究和康復血清的制備

將對乳鼠致病力強、細胞適應性好的候選毒株——O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株乳鼠MF4代病毒作1∶10研磨浸潤過夜處理后，肌肉注射2頭易感豬，觀察記錄發(fā)病情況和對豬的毒力，并在21d采血、分離血清，56℃滅活30min后過濾無菌處理后分裝保存，并采用O型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒和細胞中和試驗測定血清效價，用于r值的測定。

1.6 免疫原性的測定

將備選毒株各試一批疫苗進行交叉攻毒試驗，每種疫苗各免疫40kg左右的健康豬40頭，每頭免疫1頭份，分為4組，每組10頭，免疫28d后分別用檢驗用毒進行攻毒試驗，設立對照組，統(tǒng)計結(jié)果并計算保護率。

1.7 制苗候選毒株的確定

綜合分析各毒株的生物學特性、遺傳關系、抗原關系、免疫原性，從不同的譜系中選擇適宜的制苗毒株。

2 結(jié)果

2.1 病毒的鑒定

2.1.1 病毒序列測定及定型

將12株病毒進行VP1核苷酸序列分析，并與國內(nèi)外參考毒株進行比較，結(jié)果表明，12株病毒均為O型口蹄疫病毒，同源性見表1。12株病毒與OZK的VP1序列的同源性為 76～97%。

2.2 病毒的生物學特性

2.2.1 對豬的致病力研究和康復血清的制備

O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株乳鼠MF4代病毒接種豬后，分別于24～48h后發(fā)病，表現(xiàn)明顯的口蹄疫臨床癥狀。最早可見蹄部病變，隨后10d后開始康復。

2.2.2 抗原關系分析

選擇血清抗體效價較高的豬血清用于中和試驗，將O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11細胞毒分裝，上述3種血清分別與4個病毒株進行交叉細胞中和試驗，試驗重復3次計算平均值，見表2。

由表中數(shù)據(jù)可知O/GX/09-7和O/XJ/10-11可以作為疫苗毒株以最大限度覆蓋目前的豬口蹄疫病毒。

2.2.3 制苗候選毒株的確定

通過對12株病毒生物學特性的研究和遺傳學關系分析，選擇了分屬于Cathay拓撲型、中東-南亞拓撲型和東南亞拓撲型的3株病毒O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株，其對乳鼠、細胞都表現(xiàn)出良好的適應性和較強的毒力，3株病毒均表現(xiàn)出良好的免疫原性，綜合分析O/GX/09-7和O/XJ/10-11可以作為制苗株的候選毒株。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)VP1核苷酸序列測定，分析研究12株病毒屬于中國拓撲型、中東-南亞拓撲型、東南亞拓撲型三個拓撲型[4]，分別經(jīng)過乳鼠適應性及毒力測定、細胞適應性及毒力比較、試驗室細胞傳代和生產(chǎn)用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)特性比較和毒力測定、對豬感染性測定和康復學清制備、細胞中和試驗r值測定、單價疫苗制備和豬體攻毒交叉保護試驗、免疫原性測定，綜合分析后篩選發(fā)現(xiàn)O/HB/07/4、O/GX/09/7、O/XJ/10-11 3個毒株對試驗動物和本動物毒力強，對BHK-21細胞具有良好的適應性，免疫原性好，生物學特性符合疫苗毒株的要求，但其單苗免疫覆蓋面有限，需要進一步進行組合制備免疫覆蓋面廣德新型疫苗。

表1 12株病毒VP1核苷酸序列分析結(jié)果

表2 3種血清抗原關系

采用O/HB07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株的遺傳關系分析、乳鼠及細胞適應性研究、抗原關系測定、免疫原性等方法綜合研究，全面對豬群中流行的不同拓撲性O型口蹄疫病毒進行分析，初步掌握了豬群中O型病毒的抗原關系，為研究保護覆蓋面較為寬的豬O型口蹄疫滅活疫苗提供了支持。

目前我國豬群中主要流行O型口蹄疫病毒，分屬于Cathay拓撲型、中東-南亞拓撲型、東南亞拓撲型，長期以來，豬群中一直以Cathay拓撲型占優(yōu)勢，經(jīng)過多年的遺傳演化，進一步可以分為老毒株和新型毒株。在豬群中不時有中東南亞拓撲型的泛亞毒株流行。2010年前后由于新毒株侵入，又有東南亞拓撲型的緬甸-98型毒株流行。

緬甸-98譜系從2003年就已有該譜系病毒流行，近年來逐漸流行面擴大，從一個側(cè)面反映出現(xiàn)流行疫苗存在一些問題。該譜系病毒不易直接適應BHK-21細胞，但是經(jīng)過傳代3次后收毒，綜合評價其細胞毒價和乳鼠毒價，有良好的乳鼠適應性和細胞適應性。綜合考慮，O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株MF 4代病毒接種豬后，發(fā)現(xiàn)部分豬肌肉注射接種病毒后無任何反應，觀察10d后再采血檢測血清抗體仍然維持陰性，提醒試驗研究時應注意選擇動物和疫苗質(zhì)量評價，選擇動物時不僅要注意有無口蹄疫抗體，還要注意豬的易感性，同時提醒應注意研究口蹄疫不同感染途徑與致病性的關系。

[1]王繼華,邵明,施程洪,等.抗原濃縮純化工藝降低口蹄疫O型和Asia 1型二價滅活疫苗免疫副反應研究[J].中國預防獸醫(yī)學報,2011(1):58-61.

[2]王繼華,邵明,施程洪,等.抗原濃縮純化工藝對口蹄疫滅活疫苗免疫效果評價[J].中國獸醫(yī)學報,2011,31(5):684-686.

[3]庫大亮,李冬.口蹄疫滅活疫苗的生產(chǎn)工藝概述[J],中國獸藥雜志,2011,45(1):41-44.

[4]周春雷,李冬.口蹄疫及其防制簡介[J].中國動物保健,2011(10):40-44.