雷宇平 張仲萍 羅甜甜 （山西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 030027)

山西省豬胸膜肺炎放線桿菌分離及藥敏實(shí)驗(yàn)

雷宇平 張仲萍 羅甜甜 （山西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 030027)

為了解山西省胸膜肺炎放線桿菌的流行分布及耐藥情況，以確定有效的防控措施和用藥計(jì)劃，從山西省20個(gè)豬場(chǎng)采集疑似豬傳染性胸膜肺炎的病料組織，經(jīng)分離培養(yǎng)、生化鑒定、PCR檢測(cè)和藥敏實(shí)驗(yàn)。確定3株分離株為豬胸膜肺炎放線桿菌。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3株菌對(duì)頭孢克肟、氟苯尼考和氨芐西林最為敏感；對(duì)阿莫西林、恩諾沙星、環(huán)丙沙星等7種抗菌藥物為中敏；而對(duì)鏈霉素、慶大霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素和氯霉素表現(xiàn)出耐藥性。

胸膜肺炎放線桿菌；分離鑒定；PCR檢測(cè)；耐藥性

胸膜肺炎放線桿菌 （Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬，是革蘭氏陰性桿菌，有很強(qiáng)的致病性，能夠引起豬傳染性胸膜肺炎。豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌可以經(jīng)消化道和呼吸道感染各年齡段的豬群[1]，最常見(jiàn)的病理變化是肺臟出血、壞死和纖維素性滲出。急性感染的豬死亡率高，慢性感染的豬生長(zhǎng)緩慢、飼料報(bào)酬低[2]。該病在我國(guó)的發(fā)生率逐年上升，已經(jīng)嚴(yán)重危害到我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[3-5]。APP血清型有15種[6]，地域分布廣，再加上長(zhǎng)期不合理地使用抗菌藥物使其產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致該病的診斷和防控工作異常艱巨。為了解山西省APP的流行分布及耐藥情況，以確定有效的防控措施和用藥計(jì)劃，本研究于2014年對(duì)山西省11個(gè)地區(qū)的20個(gè)豬場(chǎng)進(jìn)行了調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 病料

2014年1月至12月，從山西省11個(gè)地區(qū)豬場(chǎng)采集病死豬的肺臟、肝臟、心臟、脾臟等病變組織。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；微量生化管、藥敏紙片購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司；Premix Taq，DL2000 DNA Marker ladder購(gòu)于寶生物工程 （大連）有限公司。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無(wú)菌取病料，用接種環(huán)在血平板上劃線，置于10%CO2，37℃培養(yǎng)24h，將疑似菌落接種到麥康凱培養(yǎng)基上。

1.4 生化試驗(yàn)

將純化的細(xì)菌接種到微量生化管中，置于10%CO2，37℃培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。

1.5 藥敏試驗(yàn)

采用K-B藥敏紙片法，將純化的菌落均勻涂布于瓊脂平板上，將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)12～16h，觀察結(jié)果，并依據(jù)藥敏試驗(yàn)抑菌環(huán)直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判定試驗(yàn)結(jié)果。

1.6 致病性試驗(yàn)

將分離獲得的菌株活化后接種于5% （v/v）的綿羊血瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24h后，稀釋菌液，使其濃度為3×1010cfu/ml。取80只40日齡的豬，隨機(jī)分成試驗(yàn)組1（菌株1），試驗(yàn)組2（菌株2），試驗(yàn)組3（菌株3）和對(duì)照組，每組20只，試驗(yàn)組各豬予肌肉注射3ml各分離菌株，對(duì)照組各豬肌肉注射等體積滅菌生理鹽水。觀察發(fā)病和死亡情況、剖檢變化，并進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.7 PCR檢測(cè)

根據(jù)Alain[7]等的方法，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)針對(duì)APP保守序列APXIV的特異性引物：上游：5'-TGGCACTGACGGTGATGA-3'，下游：5'-GGCCATCGACTCAACCAT-3'，對(duì)分離株進(jìn)行PCR檢測(cè)。用DNA提取試劑盒制備分離株的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，加入酶、引物和ddH2O后，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10min。取5μL PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)特征

該菌在10%CO2，37℃培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)良好，24h形成1～2mm濕潤(rùn)、半透明、邊緣整齊的菌落。經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢為陰性小桿菌，菌體平直，單個(gè)或雙個(gè)存在。

2.2 生化實(shí)驗(yàn)

3株分離株生化鑒定結(jié)果完全相同 （表1），葡萄糖、甘露糖、果糖、麥芽糖、VP試驗(yàn)、尿素酶、氧化酶、透明質(zhì)酸酶和過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性；甘露醇、山梨醇和MR實(shí)驗(yàn)為陰性。

表1 菌株的生化鑒定結(jié)果

2.3 PCR鑒定

對(duì)菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增出422bp的片段 （附圖），說(shuō)明該菌株為胸膜肺炎放線桿菌。

附圖 PCR檢測(cè)結(jié)果

2.4 致病性試驗(yàn)

40日齡試驗(yàn)豬感染后，各實(shí)驗(yàn)組第2天豬群開(kāi)始發(fā)病，試驗(yàn)組1有13只發(fā)病，試驗(yàn)組2有15只發(fā)病，試驗(yàn)組3有14只發(fā)病，第3天各試驗(yàn)組試驗(yàn)豬均發(fā)病并出現(xiàn)臨床癥狀，主要癥狀為精神沉郁，高溫，呼吸困難。第4天出現(xiàn)死亡高峰，剖檢可見(jiàn)纖維素性胸膜炎非常明顯，嚴(yán)重的發(fā)現(xiàn)肺實(shí)質(zhì)黏附在胸膜壁上。取病死豬的肺部進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，其生化特性與接種菌一致。

2.5 藥敏試驗(yàn)

由表2可見(jiàn)，3株菌對(duì)頭孢克肟、氟苯尼考和氨芐西林最為敏感；對(duì)阿莫西林、恩諾沙星、環(huán)丙沙星等7種抗菌藥物為中敏；對(duì)鏈霉素、慶大霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素和氯霉素表現(xiàn)出耐藥。

表2 分離豬傳染性胸膜放線桿菌藥敏試驗(yàn)

3 討論

目前，實(shí)驗(yàn)室常用的APP診斷方法有血清學(xué)試驗(yàn)包括間接凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、玻片凝集試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和ELISA等方法。由于APP有很多血清型，各血清型之間沒(méi)有很好的交叉反應(yīng)[8]，從而會(huì)影響血清學(xué)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。而細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)等方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，建立一種方便快捷并且靈敏度高的診斷方法非常必要。

根據(jù)瑞士Alain Schaller[7]報(bào)道，以App所有血清型菌株做模板，用PCR方法都能擴(kuò)增出APX IVA基因片段，而從其他親緣關(guān)系相近的細(xì)菌中無(wú)法擴(kuò)增這一片段，說(shuō)明APX IVA基因具有很高的種特異性。因此本研究參照Alain的方法，對(duì)3株分離株進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示，3株分離株均為胸膜肺炎放線桿菌。在此基礎(chǔ)上，本研究繼續(xù)對(duì)這3株APP進(jìn)行常用抗菌藥物敏感性試驗(yàn)。結(jié)果顯示3株胸膜肺炎放線桿菌對(duì)鏈霉素、慶大霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素和氯霉素表現(xiàn)出耐藥性且都表現(xiàn)出多重耐藥，這與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的報(bào)道[9-11]存在一定差異。究其原因可能是各地區(qū)使用的抗菌藥物種類和用藥時(shí)間有差異，也可能與細(xì)菌的血清型不同有關(guān)。

本研究通過(guò)對(duì)山西省11個(gè)地區(qū)20個(gè)豬場(chǎng)采集病料組織，經(jīng)過(guò)細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化培養(yǎng)和PCR鑒定，獲得3株胸膜肺炎放線桿菌。對(duì)3株分離株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)測(cè)定，結(jié)果顯示對(duì)鏈霉素、慶大霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素和氯霉素表現(xiàn)出耐藥性。本研究為山西地區(qū)豬場(chǎng)防控APP，指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物提供了科學(xué)依據(jù)。

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山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目；項(xiàng)目名稱：豬工廠化健康養(yǎng)豬精準(zhǔn)技術(shù)體系研究——豬呼吸系統(tǒng)主要細(xì)菌病綜合防控技術(shù)研究；項(xiàng)目編號(hào)：20140311020—6。