黃偉偉 盧建 董云巧 陳創(chuàng)奇 楊曦 尹愛華

(1.廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 511400； 2. 河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南 洛陽 471003)

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應(yīng)用aCGH技術(shù)建立胚胎植入前遺傳學(xué)篩查

黃偉偉1盧建1董云巧1陳創(chuàng)奇1楊曦2尹愛華1

(1.廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 511400； 2. 河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南 洛陽 471003)

目的 應(yīng)用微陣列比較基因組雜交技術(shù)(aCGH)對移植前胚胎進(jìn)行染色體遺傳學(xué)篩查，建立胚胎染色體非整倍體檢測方法。方法 對冷凍囊胚、對照質(zhì)控品先進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，然后再繼續(xù)aCGH檢測。結(jié)果 4個冷凍囊胚中1個染色體正常，另外3個染色體異常，對照質(zhì)控全部檢測出。結(jié)論 應(yīng)用全基因組擴(kuò)增以及aCGH 技術(shù)，對囊胚成功進(jìn)行了植入前遺傳學(xué)篩查，能夠全面評估胚胎染色體的非整倍體情況，為復(fù)發(fā)流產(chǎn)患者提高生殖成功率提供重要依據(jù)。

全基因組擴(kuò)增；比較基因組雜交；非整倍體；植入前遺傳學(xué)篩查

輔助生殖中常出現(xiàn)胚胎發(fā)育停滯、反復(fù)種植失敗及多次自然流產(chǎn)，原因多為胚胎染色體異常、非整倍體為主要因素，包括單體、三體(常見13、15、16、18、21、22、和X)及嵌合體等。有研究顯示，流產(chǎn)胚胎的50%～60%左右存在染色體核型異常[1]。胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(preimplantation genetic screening, PGS) 便是一種在體外受精后活檢，進(jìn)行染色體非整倍性篩查, 選擇染色體整倍性的胚胎植入,提高胚胎妊娠成功率和降低流產(chǎn)率的輔助技術(shù)，是一種低風(fēng)險的植入前遺傳學(xué)檢測技術(shù)[1]。染色體行微陣列比較基因組雜交(array comparative genomichybridization, aCGH) 檢測,一次可以檢測所有的染色體數(shù)目異常以及每條染色體全長的情況[2-4]。對復(fù)發(fā)流產(chǎn)患者進(jìn)行PGS檢測，以期能提高輔助生殖成功幾率[5]。

1 資料與方法

1.1 研究對象 胚胎：選取本院生殖健康與不孕癥科行體外受精胚胎移植并已分娩正常嬰兒的患者凍存的受精胚胎，常規(guī)解凍后存活的胚胎用于本研究?；颊叻驄D均自愿放棄冷凍胚胎，同意捐獻(xiàn)用于科研，簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 胚胎活檢可活檢 將冷凍的胚胎復(fù)蘇，用激光在透明帶空隙較大處打孔，然后換囊胚培養(yǎng)液行囊胚培養(yǎng)，在顯微操作儀下用固定針避開內(nèi)細(xì)胞團(tuán)固定囊胚，活檢針從擴(kuò)張出的滋養(yǎng)層細(xì)胞處吸取4～10個細(xì)胞，邊抽吸邊用激光從細(xì)胞連接處打斷后吸取細(xì)胞團(tuán)?；顧z獲得的滋養(yǎng)層細(xì)胞，用1×PBS(simga, 美國)各洗滌3遍，移入預(yù)先加入5μl無核酸水的PCR 管中。

1.2.2 全基因組擴(kuò)增 采用試劑盒WGA4(美國Sigma) 對單細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(whole genome amplification，WGA),設(shè)置末次洗滌液作為空白對照，正常男性為參考DNA(100pg)[6]，13、18、21-三體DNA(100pg)作為陽性對照，正常女性DNA(100pg)作為陰性對照。WGA4包括細(xì)胞裂解DNA 片段化、擴(kuò)增前處理和擴(kuò)增3 個步驟。WGA的擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 染色體非整倍性篩查 采用美國agilent公司aCGH芯片檢測系統(tǒng)。待檢胚胎和正常男性參考DNA、16、18、21-三體、正常女性DNA經(jīng)過全基因組擴(kuò)增后，各取13μl經(jīng)過熒光標(biāo)記、 純化、雜交、洗滌、掃描等步驟獲得掃描圖片, Feature Extraction 10.7.3.1軟件(美國agilent公司) 進(jìn)行圖片數(shù)據(jù)提取，應(yīng)用CytoGenomics 2.7.8軟件(美國agi-

lent公司) 進(jìn)行染色體分析。具體實驗流程參考agilent公司的Oligonucleotide Array-Based CGH for Single Cell Analysis標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(www.genomics.agilent.com)。

2 結(jié)果

從電泳圖上(圖1)可以看出，除空白對照外，其余樣品均擴(kuò)增出彌散帶，說明WGA4擴(kuò)增成功。

圖1 全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

M：DNA Marker，1：正常男性參照，2：正常女性對照，3：16-三體對照，4:18-三體對照，5：21-三體對照，6-9:4個囊胚，10：空白對照

數(shù)據(jù)分析軟件CytoGenomics 2.7.8使用ADM-2(Aberration Detection Method-2 algorithm)算法閾值為6.0，染色體缺失探針的閾值log2為0.45，染色體重復(fù)探針的閾值log2為0.35，經(jīng)過aCGH分析，三個陽性對照分別檢查出13、18、21-三體，也檢測出正常女性對照；4個囊胚分別為：正常、14-三體、18和21-三體、22單體，如圖2所示。

圖2 4個囊胚的PGS分析結(jié)果

3 討論

單細(xì)胞24條染色體非整倍體分析，非常重要的第一步就是進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，由于單細(xì)胞DNA的含量僅為6～7pg(Dolezel et al., 2003)，而微陣列芯片檢測需要納克級的DNA才能進(jìn)行，所以開展PGS 需要進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。目前，全基因組擴(kuò)增主要基于3種原理[7]：①聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，使用隨機引物或部分隨機引物通過熱循環(huán)擴(kuò)增，對隨機片段化的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以Sigma公司的“GenomePlex” 技術(shù)為代表(WGA4)；②多重置換擴(kuò)增(multiple displacement amplification，MDA)，是一種非PCR的擴(kuò)增技術(shù)，在恒溫條件下，使用Phi29DNA聚合酶、隨機引物進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，Phi29DNA聚合酶具有較高的擴(kuò)增效率和保真性，擴(kuò)增產(chǎn)物大于10kb，以Qiagen公司的“REPLI-g”技術(shù)為代表；③多重退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)，該法通過準(zhǔn)線性預(yù)擴(kuò)增來降低非線性產(chǎn)物，使用由27個堿基的特異接頭和8個堿基的隨機序列組成的引物，在0℃時引物均勻地雜合到模板DNA上，65℃時具有鏈置換活性的DNA聚合酶發(fā)生作用，生成0.5～1.5kb中間產(chǎn)物，而后94℃發(fā)生變性，接著58℃退火，這些中間產(chǎn)物作為模板聚合形成兩端序列反向互補的環(huán)狀產(chǎn)物(避免產(chǎn)物交叉雜交)，5個循環(huán)后進(jìn)行PCR，產(chǎn)物可達(dá)到數(shù)微克[8]。

PCR全基因組擴(kuò)增和MDA全基因組擴(kuò)增方法，臨床應(yīng)用較為普遍，Nathan R. Treff[9]將PCR基礎(chǔ)的全基因組(simga WGA4試劑盒)和MDA全基因組擴(kuò)增(qiangen REPLI-g試劑盒、GE GenomiPhi DNA 擴(kuò)增試劑盒)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)WGA4試劑盒更適合進(jìn)行微陣列拷貝數(shù)變異分析(CNV)。MALBAC全基因組擴(kuò)增方法由ZongChenghang[8]2012年首次提出，目前臨床應(yīng)用較少，但其優(yōu)越性較其他幾種擴(kuò)增方法顯而易見，相信以后會是微陣列和二代測序重要的伴侶。全基因組擴(kuò)增必須在沒有序列傾向性的前提下大幅度提高DNA的總量，但是沒有一種全基因組擴(kuò)增方法能保證單細(xì)胞擴(kuò)增的線性，主要涉及等位基因丟失、等位基因擴(kuò)增不一致等，有可能會導(dǎo)致aCGH無法準(zhǔn)確檢測出相應(yīng)的染色體缺失或重復(fù)，不同的芯片檢測平臺，需要應(yīng)用其適應(yīng)的WGA方法[3]。我們使用PCR基礎(chǔ)的Sigma公司W(wǎng)GA4試劑盒，能明顯地檢測出13、18、21-三體3個陽性對照和1個正常女性對照，囊胚細(xì)胞的PGS檢測的結(jié)果也顯著。

PGS獲取生殖細(xì)胞或胚胎組織的方法主要有2種：卵裂球活檢及囊胚細(xì)胞活檢。卵裂球活檢：體外授精后第3天，胚胎發(fā)育到6～10 細(xì)胞期, 從中取出1～2個卵裂球行染色體分析，卵裂期染色體嵌合發(fā)生率較高, 此時的染色體分析可能代表不了胚胎的染色體組成[10]。囊胚細(xì)胞活檢( blastocyst biopsy) ：在體外授精后的第5 天或第6 天進(jìn)行, 胚胎發(fā)育成滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞(發(fā)育為胎盤)和內(nèi)胚層細(xì)胞(發(fā)育為胎兒)[2]。囊胚期PGS只取滋養(yǎng)外胚層5～10 個細(xì)胞進(jìn)行檢測，而保持了胎兒的內(nèi)胚層細(xì)胞的完整性[11]。另外從卵裂球到囊胚期發(fā)育過程中，染色體有問題的細(xì)胞會被自然淘汰；在囊胚期較卵裂期取得的單細(xì)胞量大，PGS分析結(jié)果更加穩(wěn)定。隨著囊胚培養(yǎng)、胚胎冷凍和解凍技術(shù)的提高，囊胚滋養(yǎng)外胚層活檢憑借其對胚胎損傷小、染色體整倍性比率高、 嵌合少的優(yōu)點, 已逐漸被臨床推廣應(yīng)用[1]。PGS陽性對照、正常女性對照的檢測結(jié)果與樣品類型一致；活檢的4個囊胚中1正常，其余3個異常。本實驗結(jié)果表明，應(yīng)用aCGH技術(shù)成功建立了一種對早期胚胎進(jìn)行植入前遺傳學(xué)篩查的方法。

PGS使產(chǎn)前篩查檢測時間已經(jīng)從孕11～13周提前到胚胎植入前，為更好的降低出生缺陷提供了幫助。傳統(tǒng)的熒光原位雜交技術(shù)也能用于PGS, 但只能對 3～7對染色體的檢測, 不能完全反映 23 對染色體的總體狀況。aCGH應(yīng)用于PGS，不需要針對異常位點制備特殊的探針，一次可以檢測24條染色體非整倍體數(shù)目異常以及染色體重復(fù)和缺失，并且能獲得異常片段的位置和大小，該技術(shù)具有通量高、靈敏度高等特點，可以在24小時完成檢測。雖然 aCGH應(yīng)用于PGS有許多優(yōu)點, 但該技術(shù)也存在一定的局限性，檢測分辨率只有5～10Mb，另外aCGH不能檢測出點無染色體拷貝數(shù)變化的結(jié)構(gòu)異常，如平衡易位和倒位等，對嵌合體、多倍體和單倍體的檢測能力。

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編輯：宋文穎

Objective By using the technique of microarray comparative genomic hybridization (aCGH), the aim of this study is to carry out preimplantation genetic screening and establish a method for the detection of chromosomal aneuploidy. Method Whole genome amplification (WGA) was performed on the frozen blastocyst and control samples, and then the products of WGA were detected by aCGH. Results One of the four frozen embryos was normal, while the others were abnormal.The controls have all been successfully detected, just as expected. Conclusions The application of WGA combined with aCGH has been proved to be effective in embryo preimplantation genetic screening. It can help to comprehensively evaluate the chromosomal aneuploidy in embryos, and thus provid an important foundation for improving the reproductive success rate of patients with recurrent spontaneous abortion.

whole genome amplification(WGA)； microarray comparative genomic hybridization(aCGH)； aneuploidy；preimplantation genetic screening(PGS)

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.03.004

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(31401136)；廣東省自然科學(xué)基金(S2012010008318)

R714.55

A

2016-05-30)

*通信作者：尹愛華，E-mail：yinaiwa@vip.126.com