楊潔霞 郭芳芳 彭海山 齊一鳴 王東梅 侯亞平 歐陽浩新 尹愛華

(廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 511442)

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無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)在胎兒染色體非整倍體篩查中的應用研究

楊潔霞 郭芳芳 彭海山 齊一鳴 王東梅 侯亞平 歐陽浩新 尹愛華*

(廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 511442)

目的 探討高通量測序平臺的無創(chuàng)基因檢測技術(shù)應用于產(chǎn)前診斷的可行性。方法 選擇2012年4月到2013年5月在廣東省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診,孕齡12～32周的3711例單胎妊娠高危孕婦,記錄臨床指征、年齡、孕周等數(shù)據(jù)。采用高通量測序平臺的無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)對其外周血游離胎兒DNA進行分析。檢測結(jié)果為高危的孕婦行羊膜腔穿刺或臍血穿刺術(shù)進行胎兒染色體核型分析。結(jié)果 3711例孕婦中游離胎兒DNA高通量基因測序技術(shù)檢測出74例染色體高風險胎兒，羊水/臍血核型分析證實其中59例為染色體異常，分別為41例21-三體和8例18-三體，4例13-三體，5例性染色異常，1例其他常染色異常，1例21-三體和7例其他染色體異常證實為假陽性。結(jié)論 利用高通量測序平臺的無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)可快速、準確地檢測出胎兒13、18、21染色體非整倍體異常，其敏感性、特異性與染色體核型分析技術(shù)具有較高的一致性。但是對于其他染色體異常準確性還有待技術(shù)完善來進一步提高，對于染色體微缺失、微重復的檢測也日益受到眾多專家學者的關注，這也是我們以后研究的方向之一。

游離DNA；染色體非整倍體；無創(chuàng)；產(chǎn)前診斷

出生缺陷是影響出生人口素質(zhì)的重要問題，中國每年有1600萬新生兒出生，出生缺陷率4%～6%。而染色體異常是導致出生缺陷的重要因素，唐氏綜合征又稱先天愚型或 21-三體綜合征，是新生兒常見的染體病，發(fā)生率約為 1/800,占小兒三體型染色體70%～80%[1]。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法是通過獲取胎兒的絨毛、羊水、臍血或者胎兒的組織來進行診斷，這些手段不容易被妊娠婦女接受；并且也對孕婦和胎兒產(chǎn)生一些潛在的風險[2]。傳統(tǒng)的唐氏綜合征篩查血清學和超聲篩查方法，靈敏度不夠，檢出率低[3]，1997年Lo等[4]發(fā)現(xiàn)妊娠婦女的血漿和血清中含有游離的胎兒DNA，為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供了新的可能。近年來大規(guī)模平行測序技術(shù)應用于產(chǎn)前診斷，為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供了堅實的技術(shù)保障，開辟一條切實可行的有臨床應用價值的道路[5]。章容等[6]應用無創(chuàng)MPS與染色體非整倍篩查已有相關研究，本文總結(jié)了迄今已經(jīng)完成3711例孕婦的無創(chuàng)篩查結(jié)果，旨在探討非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測在產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象 選擇2012年2月至2013年5月在廣東省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診，高齡妊娠、唐氏綜合征篩查異常孕婦3711例，因有4例無法得到檢測結(jié)果而剔除，共計3707例納入研究，對其進行常規(guī)方法產(chǎn)前診斷和無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測方法的介紹，經(jīng)過知情同意、自愿選擇接受無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測，孕齡為12～34周，孕婦年齡17～45歲，B超提示宮內(nèi)妊娠單活胎。每個參與者簽署知情同意書后抽取外周靜脈血5ml。

1.2 樣本采集、分離 取孕婦外周靜脈血5ml，EDTA-K2抗凝，1600×g 離心10分鐘，上清血漿分離后再次以16000×g離心10 分鐘。以上兩次離心步驟須在采血后的8小時內(nèi)進行，血漿存放-80℃冰箱進一步凍存。

1.3 DNA提取和測序分析 600μl母體血漿提取血漿DNA，嚴格按照說明書操作。提取過程中應設置陰性對照。提取后的DNA在-80℃條件下保存。提取的血漿DNA進行文庫構(gòu)建。使用Q-PCR檢測文庫產(chǎn)量，定量好的文庫經(jīng)Life Proton測序。1.4 數(shù)據(jù)分析 將孕婦血中所有游離DNA全部進行測序，獲得分布在每條染色體上真實核酸片段的數(shù)量，測序結(jié)果經(jīng)比對、拼接、計算k-mer覆蓋度[7]，根據(jù)生物信息學分析，計算出每條染色體對應的覆蓋深度值，并轉(zhuǎn)化為衡量風險的風險指數(shù)，確定胎兒患染色體非整倍體的風險。

1.5 胎兒染色體核型確診方法 無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測結(jié)果高風險的孕婦，在知情同意原則下行介入性產(chǎn)前診斷，即采集胎兒羊水或臍血，經(jīng)細胞培養(yǎng)后行染色體核型分析或array CGH檢測確定染色體異常。

1.6 隨訪結(jié)果分析處理 對每一位接受檢測的孕婦進行妊娠結(jié)局的隨訪跟蹤，記錄胎兒出生后情況，有無漏診病歷，以便分析無創(chuàng)檢測方法的檢出率、假陰性率、假陽性率等。

1.7 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 接受無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測的孕婦的臨床資料(表 1) 平均年齡(28±5.41)歲，平均孕周(18±4.12)周。

2.2 無創(chuàng)結(jié)果高風險孕婦介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果 無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測共提示74例染色體數(shù)目異常，其中 21-三體43 例、18-三體 10例、13-三體6例、性染色體異常7例、其他染色體異常8例。74例高風險患者中70 例同意做介入性產(chǎn)前診斷，采集胎兒羊水或臍血，經(jīng)細胞培養(yǎng)后行染色體核型分析或array CGH確定染色體非整倍體。確認異常核型 53 例(75.71%)，結(jié)果見表 2。結(jié)合隨訪結(jié)果，對21-三體檢出率為100%(41/41)，漏診率為0，誤診率為0.027%(1/3707)；18-三體檢出率為100%(8/8)，漏診率為0，誤診率為0.027%(1/3707)；對13-三體檢出率為100%(4/4)，漏診率為0，誤診率為0.054%(2/3707)。

2.3 無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)對性染色體及其他常染色體的檢出情況 該方法共檢出性染色體異常7例，7例孕婦全部接受產(chǎn)前診斷染色體核型分析(結(jié)果見表3)，檢出率為100%(5/5)，漏診率為0，誤診率為0.054%(2/3707)。檢出其他常染色體異常8例，全部接受羊水或臍血穿刺行array CGH檢測，1例結(jié)果異常，檢出率100%，誤診率0.19%(7/3707)。

表1 3707例無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測孕婦標本臨床資料

表2 無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測高風險結(jié)果與介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果比較

注：*1例拒絕做進一步檢查，直接引產(chǎn)；◆1例超聲畸形直接引產(chǎn)；☆2例超聲畸形直接引產(chǎn)

表3 無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測對性染色體異常的檢出情況

3 討論

染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常所致的疾病稱為染色體病[8]。染色體病沒有有效的治療方法，染色體病患兒一旦出生，給家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟壓力和精神負擔，目前主要通過產(chǎn)前篩查和診斷避免患兒出生。通用的產(chǎn)前篩查方法是檢測與染色體非整倍體異常相關的因素[9]，但是目前的唐氏綜合征篩查方案有5%的假陽性率，而篩查準確率也只有70% 或85%[10]。這些篩查高風險的孕婦需要進行進一步侵入性產(chǎn)前診斷，對孕婦和胎兒都存在一定的風險。1997年Lo等[4]發(fā)現(xiàn)妊娠婦女的血漿和血清中含有游離的胎兒DNA，為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供了新的可能。以及高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，大大提高了染色體非整倍體異常的檢出率，結(jié)合隨訪結(jié)果，該方法對21-三體檢出率100%，漏診率為0，誤診率為0.027%；18-三體檢出率100%，漏診率為0，誤診率為0.027%；對13-三體檢出率100%，漏診率為0，誤診率為0.054%?？捎型娲舾卸容^低的傳統(tǒng)血清學篩查方法。這一點國內(nèi)學者章容等[6]已有大樣本的研究證明。

孕婦外周血中的游離胎兒DNA 之所以可以運用于無創(chuàng)性產(chǎn)前基因檢測，主要因為它們存在以下幾個方面的生理特點：孕婦血中胎兒游離DNA含量相對較孕婦血中胎兒細胞豐富[1]，游離胎兒DNA保留了父母的多態(tài)性位點信息，半衰期短，大部分孕婦產(chǎn)后2小時即檢測不到胎兒游離DNA的存在[11]。 但是胎兒游離DNA也存在不穩(wěn)定的特性，呈起伏波動，因此可能存在檢測失敗的風險，Bianchi等[12]采用無創(chuàng)性產(chǎn)前基因檢測技術(shù)篩查了532例孕婦，有16例(3%)孕婦血漿未能提取出足量的胎兒DNA導致檢測失敗，我們3715例標本中95例(2.56%)重新抽血后得到檢測結(jié)果，另外還有4例(0.108%)兩次抽血后仍然無法得到明確檢測結(jié)果而予退費處理。因此我們在知情同意書里充分說明可能出現(xiàn)重新抽血或檢測不出結(jié)果可能。

無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)應用于胎兒染色體非整倍體檢測已日趨成熟，因其檢出率高而且不會對胎兒造成流產(chǎn)風險越來越被臨床醫(yī)生及孕婦群體接受，章容等[6]學者已有大樣本研究，研究結(jié)果在本研究中也充分得到印證，本研究還對無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)對性染色體和其他常染色體的檢出率做了初步分析，該方法共檢出性染色體異常7例，結(jié)合隨訪結(jié)果，計算出該方法檢出率100%，漏診率為0，誤診率為0.054%。檢出其他常染色體異常8例，全部接受羊水或臍血穿刺行array CGH檢測，1例結(jié)果異常，檢出率100%，誤診率0.19%。這些數(shù)據(jù)說明對于性染色體和其他常染色體異常還有一定的局限性，還需要更多的數(shù)據(jù)積累。

無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)與傳統(tǒng)篩查方法相比較具有明顯優(yōu)勢，但是由于其費用相對比較昂貴，同時檢測實驗室要求具備高水平的分析技術(shù)[13]，短期內(nèi)難以普及。而且對于染色體嵌合結(jié)構(gòu)[14]和微小缺失及重復等無法檢測，在臨床應用還存在一定的局限性，也決定其暫時無法取代傳統(tǒng)的血清學和超聲結(jié)合篩查方法。但是無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)具有無創(chuàng)性、高準確性、高通量等優(yōu)勢，而且可以用于單基因病、RH血型不合、以及一些其他妊娠期疾病的檢測，目前國內(nèi)外很多專家學者都在致力于這方面的研究，相信在不久的將來，該技術(shù)臨床應用前景非常廣闊，為降低中國出生缺陷做出更大的貢獻。

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編輯：劉鄧浩

Objective Using massively parallel genome sequencing technology to detect pregnant women free DNA in peripheral blood plasma,for fetal chromosomal aneuploidy noninvasive prenatal genetic testing, explore aneuploid noninvasive prenatal genetic testing in the value of prenatal screening and prenatal diagnosis. Method From February 2012 to May 2013, a total of 3711 high-risk pregnant women were recruited at Prenatal Diagnostics Center of Guang dong Province MCH，with gestational age from 12 to 34 weeks. Five milliliters of peripheral blood were drawn, the DNA were extracted from mother plasma and barcoded, And test results of high risk which accepted interventional prenatal diagnosis as fetal amniotic fluid or cord blood that is collected by the cell culture underwent karyotype analysis or array-CGH identified chromosome aneuploidy.And all detected pregnant women after childbirth were followed-up. Results 3711 cases of pregnant women with a high risk of blood were 74 cases, including 21-trisomy 41 cases; 18-trisomy 8 cases, 13-trisomy 4 cases, sex chromosome abnormalities in 5 cases, other chromosomal abnormalities 1 case. Combined the results of interventional prenatal diagnosis and followed-up, detection rate of this method for 21-trisomy(40/41)、18-trisomy(8/8)、13-trisomy(4/4) reach 100%,the misdiagnosis rate is 1.08%; sex chromosome detection rate and other chromosome detection rate of 100% (6/6), the misdiagnosis rate of 2.43%. Conclusions Using non-invasive prenatal genetic testing to detect maternal blood plasma of free fetal chromosomal DNA lines aneuploidy screening for 21-trisomy 、18-trisomy and 13-trisomy , the sensitivity, specificity and chromosomal karyotyping have high consistency. But for the sex chromosomes and other chromosomal abnormalities often have some limitations, but also need more data accumulate. The technology has the non-invasive, high accuracy, high throughput advantages in clinical which have considerable potential value.

cffDNA； chromosome aneuploidy；non-invasive；prenatal diagnosis

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.03.007

R714.55

A

2016-05-18)

*通訊作者：尹愛華，E-mail:yinaiwa@vip.126.com