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        腦心通對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織細胞內(nèi)Ca2+的影響

        2016-11-30 19:43:20杜培坤李妍怡王艷玲金紅
        關(guān)鍵詞:腦心通

        杜培坤+李妍怡+王艷玲+金紅

        【摘要】目的 探討腦心通對缺血再灌注導致神經(jīng)細胞損傷的保護機制。方法 采用反復夾閉雙側(cè)頸總動脈結(jié)合鼠尾放血引起循環(huán)血量減少的方法制備擬腦缺血再灌注損傷大鼠模型,觀察大鼠腦組織細胞內(nèi)Ca2+含量,并做海馬區(qū)HE染色,觀察海馬組織的病理改變。結(jié)果 腦海馬細胞內(nèi)Ca2+含量明顯降低。結(jié)論 腦心通可以減少腦缺血再灌注損傷后細胞外Ca2+進入細胞內(nèi),從而可以防止細胞內(nèi)Ca2+超載損傷,保護腦組織及神經(jīng)細胞。

        【關(guān)鍵詞】腦心通;缺血再灌注;Ca2+

        【中圖分類號】R285 【文獻標識碼】B 【文章編號】ISSN.2095-6681.2016.04..03

        急性缺血性腦血管病是危害人類健康的常見病和多發(fā)病之一,具有較高的致死率、致殘率及復發(fā)率,中醫(yī)藥對腦血管病的治療越來越受到關(guān)注,尤其中藥復方制劑可以通過多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點作用于腦缺血各環(huán)節(jié),其中腦心通膠囊是由黃芪、丹參、桃仁、紅花、地龍等中藥組成的復方制劑,多項研究表明,腦心通膠囊治療氣虛血瘀、脈絡(luò)閉阻導致的中風臨床療效確切,是臨床防治缺血性腦卒中的有效藥物[1]。為探討其治療急性缺血性腦血管病的部分作用機制,本實驗用反復夾閉雙側(cè)頸總動脈結(jié)合鼠尾放血的方法制備擬腦缺血再灌注損傷大鼠模型,觀察大鼠腦組織細胞內(nèi)Ca2+含量變化及海馬組織的病理改變進行研究。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        選用4月齡無特定病原體(SPF)級SD大鼠50只,步長腦心通膠囊,細胞內(nèi)鈣離子測試劑,流式細胞儀。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 動物分組

        選取SD大鼠50只,雌雄各半,隨機分為空白組10只和假手術(shù)組10只,余30只造模。然后再采用卒中指數(shù)評分標準選取20只造模成功的大鼠,隨機分為模型組10只、步長腦心通組10只。

        1.2.2 模型制備

        采用由Nordtrom建立的2VO阻斷缺血模型,加鼠尾放血改良后用于本實驗模型制備[3]。要求術(shù)前禁食水。用水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠,仰臥固定,被皮,常規(guī)消毒,沿頸正中皮膚切口,再用神經(jīng)剝離器分離頸部雙側(cè)迷走神經(jīng),清晰暴露雙側(cè)頸總動脈,用無創(chuàng)動脈夾閉頸總動脈,阻斷血流10 min,間隔10 min,再用無創(chuàng)動脈夾閉頸總動脈,阻斷血流10 min,然后恢復血流。阻斷的同時,剪鼠尾放血,造成全腦血流低灌注,最后熱凝止血,造成急性腦缺血再灌注損傷動物模型。

        假手術(shù)組:與造模組操作過程大致相同,但不阻斷頸總動脈亦不放血。

        1.3 評價造模成功的標準

        采用卒中指數(shù)評分標準[3]。卒中指數(shù)評分如下:毛發(fā)臟亂、全身顫抖各1分,運動減少或遲鈍1分,耳觸覺遲鈍為3分,眼固定狀睜開為3分,后肢外展呈八字為3分,上瞼下垂為1分,轉(zhuǎn)圈為3分,驚厥或爆發(fā)運動為3分,極度虛弱為6分??偡?5分,>10分明顯有損傷。選取卒中指數(shù)>10分的動物為造模成功的

        動物。

        1.4 指標檢測

        用流式細胞儀檢測腦組織海馬區(qū)Ca2+。用光學顯微鏡觀察大鼠腦組織海馬CA1區(qū)的形態(tài)學變化。

        1.5 統(tǒng)計學處理

        數(shù)據(jù)采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件處理,計量資料以“x±s”表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 腦心通對腦缺血再灌注損傷大鼠卒中指數(shù)評分的影響

        大鼠的卒中指數(shù)評分步長腦心通組比模型組低,且隨時間推移呈遞減趨勢。第1天,步長腦心通組與模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),提示腦缺血再灌注損傷模型制備成功,并且各用藥組動物選取無差異;第6天,步長腦心通組與模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);第12天,步長腦心通組與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明步長腦心通能顯著改善模型大鼠神經(jīng)行為癥狀和體征,有較好療效,但中藥治療作用起效慢。

        見表1。

        2.2 腦心通對腦缺血再灌注損傷大鼠腦海馬組織細胞內(nèi)Ca2+含量的影響

        腦缺血再灌注后,與空白組、假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦內(nèi)海馬組織細胞內(nèi)Ca2+含量明顯升高,說明模型組發(fā)生了明顯的細胞內(nèi)Ca2+超載作用;與模型組比較,腦心通組較模型組細胞內(nèi)Ca2+含量均下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明腦心通可有效緩解腦缺血再灌注損傷后細胞內(nèi)Ca2+超載作用。見表2。

        2.3 腦心通對腦缺血再灌注損傷大鼠腦海馬組織結(jié)構(gòu)的影響

        腦心通可以減輕腦缺血再灌注引起的大鼠腦海馬組織損傷,減輕神經(jīng)細胞的水腫、變性、壞死等,保護及修復神經(jīng)細胞。

        ①空白組及假手術(shù)組:海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞呈圓形或橢圓形,分布密集,排列規(guī)則。

        ②模型組:海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞排列稀疏、紊亂,丟失嚴重,胞漿內(nèi)嗜酸性染色增強,細胞核固縮或細胞核形狀不規(guī)則,周圍間隙及血管間隙明顯

        增寬。

        ③步長腦心通組:海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞稍稀疏,呈圓形,橢圓形,或多角形,細胞排列較有序。

        3 討 論

        Ca2+廣泛分布于人體的細胞和體液之中,對細胞的代謝和功能有重要的調(diào)節(jié)作用,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),Ca2+被稱為神經(jīng)生理學家的“DNA”,它作為神經(jīng)細胞內(nèi)的重要信使,參與神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放,以及神經(jīng)細胞內(nèi)多種酶學的轉(zhuǎn)運等活動[4]。生理狀態(tài)下,細胞內(nèi)外鈣離子保持動態(tài)平衡。當腦缺血再灌注時,Ca2+平衡遭到破壞,大量Ca2+內(nèi)流引起Ca2+超載。首先能量代謝障礙,ATP耗竭,使Na+內(nèi)流,K+外流,神經(jīng)細胞模去極化,電壓依賴性鈣通道開放,Ca2+進入細胞內(nèi)增加,同時能量耗竭,鈣離子泵能量障礙,使細胞內(nèi)Ca2+傳出能力下降,可使細胞Ca2+內(nèi)超載;但細胞內(nèi)Ca2+增多主要是由敏感性、主動性的受體門控通道來完成,這些通道特別是NMDA-R激活引起門控性通道的開放,在缺血缺氧狀態(tài)下由于谷氨酸的過多釋放以及攝取障礙而被激活,導致細胞內(nèi)的Ca2+超載,引起神經(jīng)細胞病理性損傷。神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+超載時,可導致5-羥色胺及去甲腎上腺素釋放增多,引起腦血管痙攣,局部血流變狀況惡化,加重腦缺血;神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+超載時,大量Ca2+沉積于線粒體,與線粒體內(nèi)含磷酸根的化合物結(jié)合,形成不溶性磷酸鈣,造成氧化磷酸化電子傳遞脫耦聯(lián),致使膜電位喪失引起跨膜離子流失效,神經(jīng)細胞呼吸功能受到抑制,導致不可逆性神經(jīng)細胞損傷;神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+超載時,可致胞漿內(nèi)或溶酶體內(nèi)Ca2+依賴性酶類和磷脂酶類大量激活,使神經(jīng)細胞膜結(jié)構(gòu)分解,神經(jīng)細胞骨架破壞,導致神經(jīng)細胞死亡[5];神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+超載時,可激活磷脂酶A2和磷脂酶C,使膜磷脂降解,產(chǎn)生大量游離脂肪酸,特別是花生四烯酸,造成脂質(zhì)膜流動性降低及通透性增高,導致神經(jīng)細胞腫脹,以及花生四烯酸在環(huán)氧酶及脂氧酶作用下生成前列腺素、白三烯和血小板激活因子等活性物質(zhì),并在氧自由基的作用下,啟動膜脂質(zhì)過氧化,形成脂性自由基,破壞生物膜,并進一步促進受體通道興奮性氨基酸的釋放,造成興奮性氨基酸的毒性,加重神經(jīng)細胞損害[6] 。

        本實驗結(jié)果表明:中藥復方制劑腦心通可以減輕腦缺血再灌注引起的大鼠腦海馬組織損傷,減輕神經(jīng)細胞的水腫、變性、壞死等,保護腦組織;還可以減少腦缺血再灌注后細胞外Ca2+通過電壓依賴性通道和受體門控性通道進入細胞內(nèi),降低腦缺血再灌注引起的大鼠腦神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+的含量,從而可以防止細胞內(nèi)Ca2+超載引起的一系列病理損傷,保護神經(jīng)細胞。

        參考文獻

        [1] 方正龍,袁燦興,顏乾麟,等.步長腦心通膠囊治療腦卒中的臨床研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2003,1(1):

        32-34.

        [2] 何令學,尹海林.腦缺血動物模型的研究[J].中國比較醫(yī)學雜志,2004,15(4):307-310.

        [3] Zea Longa EL,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reyersible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].STROKE,2009,20:84-90.

        [4] Farber JL. The role of calcium in cell death[J].Life Sci,2010,29(13):1289-1295.

        [5] Lewen A,Matz P,Chan PH.Free radical pathways in CNS injury[J]. Neurotrauma, 2000, 17(10): 871-890.

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        本文編輯:徐 陌

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