楊玉琪+王紅梅+宋娜麗+賀錚錚+孫俊+蔡怡

摘要：目的探討中藥對(duì)HIV感染者T細(xì)胞表面PD-1和Tim-3表達(dá)水平變化的影響。方法用流式細(xì)胞分析術(shù)分別檢測(cè)用中藥扶正抗毒丸或康愛(ài)保生丸治療和未治療的HIV感染者治療前后T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)和T細(xì)胞表面PD-1和Tim-3表達(dá)。結(jié)果經(jīng)中藥扶正抗毒丸或康愛(ài)保生丸治療的HIV感染者外周血CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)維持在一定水平，T細(xì)胞表面PD-1和Tim-3表達(dá)下降，PD-1CD4陽(yáng)性細(xì)胞百分比從044%下降到034%；而未治療的HIV感染者的CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)下降，平均下降幅度為55cell/μL，T細(xì)胞表面PD-1和Tim-3表達(dá)上升，PD-1CD4陽(yáng)性細(xì)胞百分比從031%上升到039%，Tim-3CD8陽(yáng)性細(xì)胞百分比從591%上升到673%。結(jié)論中藥扶正抗毒丸或康愛(ài)保生丸治療HIV感染，一定時(shí)間內(nèi)可以穩(wěn)定HIV感染者的CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)CD4+T、CD8+T細(xì)胞表面PD-1和Tim-3表達(dá)，對(duì)延緩病程起到積極作用。

關(guān)鍵詞：艾滋病病毒感染；程序性死亡分子1；T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白結(jié)構(gòu)域分子3；扶正抗毒丸；康愛(ài)保生丸

中圖分類(lèi)號(hào)：R51291文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2016）09-0076-03

程序性死亡分子1（Programmed death-1 PD-1）和T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白結(jié)構(gòu)域分子3（T-cell immunoglobulin domain and mucin domain molecule-3 Tim-3）是近期發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞表面的共刺激分子，它們分別與各自的配體PD-L和Galectin-9結(jié)合并傳遞抑制性的第二信號(hào)[1-2]。研究表明[3-4]HIV感染者的T細(xì)胞表面增強(qiáng)表達(dá)PD-1和Tim-3，且其變化特征與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。中藥能調(diào)節(jié)免疫進(jìn)而延緩艾滋病病程進(jìn)展是否與T細(xì)胞表面PD-1和Tim-3水平表達(dá)有關(guān)？為此，筆者分析了中醫(yī)藥治療和未治療的HIV感染者治療前后外周血T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)和T細(xì)胞表面PD-1和Tim-3表達(dá)變化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料和方法

11一般資料于2014年3月—2015年11月期間在云南省紅河州建水縣中醫(yī)醫(yī)院和建水縣疾控中心診治的HIV感染者44例。根據(jù)其自愿接受中醫(yī)藥治療是否，分為中藥治療組和自然病程對(duì)照組，其中中藥治療組24例，3例為II-B期患者，CD4+T細(xì)胞為200-349 cell/μL，21例為II-A期患者，CD4+T細(xì)胞為≥350 cell/μL；自然病程對(duì)照組20例，4例為II-B期患者，CD4+T細(xì)胞為200-349 cell/μL，16例為II-A期患者，CD4+T細(xì)胞為≥350 cell/μL；所有HIV感染者臨床表現(xiàn)均未出現(xiàn)艾滋病指征性疾病。所有HIV感染者均簽定知情同意書(shū)，經(jīng)單位倫理委員會(huì)同意。

12診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《中國(guó)艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標(biāo)準(zhǔn)》[5]中HIV感染者的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。

13納入標(biāo)準(zhǔn)符合HIV感染者相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)蛋白印跡法檢查確認(rèn)HIV抗體為陽(yáng)性，既往無(wú)抗HIV感染的藥物治療史。

14治療方案自然病程對(duì)照組：根據(jù)患者的意愿，未采取與HIV感染相關(guān)治療，只定期隨訪。中藥治療組：按照中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥防治艾滋病研究中心和中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)艾滋病分會(huì)主編的《艾滋病中醫(yī)藥治療手冊(cè)》有關(guān)規(guī)定[6]，對(duì)HIV感染者開(kāi)展免費(fèi)中醫(yī)藥關(guān)懷救治，根據(jù)患者病情、癥狀分別給予口服扶正抗毒丸、康愛(ài)保生丸，或兩種制劑交替使用治療，每次3g，每日4次，連續(xù)治療12個(gè)月。扶正抗毒丸：滇藥制字（Z）20090003A，處方由黃芪、黃精、白術(shù)、女貞子等組成，具有益氣養(yǎng)陰，滋腎健脾，清熱解毒，每1g丸劑相當(dāng)原生藥44g，成人日用劑量為528g生藥?？祼?ài)保生丸：滇藥制字（Z）20090006A，處方由紫花地丁、黃芩、桑白皮、人參等組成，具有解毒清熱，活血祛濕，養(yǎng)陰益氣，每1g丸劑相當(dāng)原生藥35g，成人日用劑量為420g生藥。扶正抗毒丸或康愛(ài)保生丸均為云南省中醫(yī)藥治療艾滋病試點(diǎn)項(xiàng)目用藥，由云南省中醫(yī)中藥研究院附屬醫(yī)院提供。

15觀察指標(biāo)定期隨訪，觀察患者的病情及臨床癥狀體征變化，于治療前后分別檢測(cè)患者外周血CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)以及CD4+T、CD8+T細(xì)胞表面表達(dá)PD-1和Tim-3的陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

16實(shí)驗(yàn)室檢查采集EDTA-K2抗凝靜脈血，常溫下保存和運(yùn)輸，避免極端溫度（冷凍或過(guò)熱），24 h內(nèi)用美國(guó)BD公司FACSCalibur全自動(dòng)雙激光四色流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。采用微量全血法，分別用CD3/CD4/CD8三色熒光抗體、APC-PD-1和APC-Tim-3抗體標(biāo)記，用CellQuest Pro軟件分析CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)以及CD4+T、CD8+T細(xì)胞表面表達(dá)PD-1和Tim-3的陽(yáng)性細(xì)胞百分率?？贵w購(gòu)自美國(guó)BD公司，CD4/CD8/CD3三色熒光克隆抗體，No：39913，APC anti-human Tim-3，No：B173546，APC anti-human CD279（即PD-1），No：B171333。

17統(tǒng)計(jì)學(xué)方法全部資料均采用SPSS 170統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以表示，治療前后數(shù)據(jù)的比較運(yùn)用配對(duì)樣本T檢驗(yàn)分析。以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

21一般情況44例HIV感染者中，男24例，占5455%，女20例，占4545%，男女之比為120∶1；最大年齡64歲，最小年齡24歲，平均年齡42歲；可能感染途徑為性傳播30例，經(jīng)靜脈吸毒感染7例，輸血感染1例，原因不明6例。

22HIV感染者治療前后CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)變化見(jiàn)表1。用中藥扶正抗毒丸或康愛(ài)保生丸治療12個(gè)月的HIV感染者CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)和CD4/CD8比值穩(wěn)定在一定范圍，治療前后比較無(wú)差異（P>005）。而未治療的HIV感染者CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)下降，平均下降幅度達(dá)55 cell/μL，但與治療前比較，無(wú)明顯差異（P>005）。

3討論

近年共刺激分子在免疫調(diào)節(jié)中的作用越來(lái)越受到廣大研究者的重視，其中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用的共刺激分子PD-1和 Tim-3在 HIV 感染中的作用倍受關(guān)注。以往研究報(bào)道[7-9]，HIV感染者的T細(xì)胞表面增強(qiáng)表達(dá)PD-1和Tim-3，且其變化特征與疾病進(jìn)展密切相關(guān)，PD-1和Tim-3在HIV特異CD8+和CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)與血漿病毒載量成正相關(guān)，與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)成負(fù)相關(guān)。T細(xì)胞表面增強(qiáng)表達(dá)PD-1和Tim-3主要損傷了HIV特異性的CD8+T 細(xì)胞免疫反應(yīng)。而在抗病毒免疫中，有效而強(qiáng)大的 T 細(xì)胞免疫應(yīng)答是清除病毒的關(guān)鍵，病毒感染的持續(xù)和慢性化常常是由于效應(yīng)和記憶性 T 細(xì)胞的功能缺陷所致。在抗HIV感染臨床治療中，如能針對(duì)T 細(xì)胞表面PD-1和Tim-3表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，使機(jī)體細(xì)胞免疫充分發(fā)揮抗HIV感染，可一定程度延緩HIV感染病程進(jìn)展。

本研究結(jié)果：經(jīng)過(guò)中藥扶正抗毒丸或康愛(ài)保生丸治療12個(gè)月的HIV感染者，CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)維持在430個(gè)cell/μL以上，而未治療的HIV感染者CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)從505個(gè)cell/μL下降到450個(gè)cell/μL，其下降速度與以往報(bào)道一致，提示中藥扶正抗毒丸或康愛(ài)保生丸對(duì)穩(wěn)定HIV感染者的CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)有明顯作用。中藥治療的HIV感染者T細(xì)胞表面PD-1和Tim-3的表達(dá)與治療前比有所下降，而未治療的HIV感染者PD-1和Tim-3的表達(dá)升高，我們推測(cè)中藥扶正抗毒丸或康愛(ài)保生丸調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能可能與T細(xì)胞表面PD-1和Tim-3表達(dá)相關(guān)。

目前醫(yī)學(xué)界仍不能成功研究出徹底治愈艾滋病的方法，延緩病程進(jìn)展、降低病死率、提高患者生存質(zhì)量是當(dāng)前臨床治療的主要目的。人體免疫系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，任何環(huán)節(jié)都是相關(guān)聯(lián)的，在HIV感染的情況下，其復(fù)雜性更加難以想象。中醫(yī)藥對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用可能涉及多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)，本研究結(jié)果提示中藥扶正抗毒丸或康愛(ài)保生丸治療后，HIV感染者CD8+和CD4+T細(xì)胞上PD-1和Tim-3表達(dá)水平下降，相應(yīng)的PD-l/PD-L和Tim-3/Galectin-9這兩個(gè)信號(hào)通路就可能被阻斷或部分阻斷，HIV特異性CD4+和CD8+T 細(xì)胞功能可得到部分提高。這對(duì)于恢復(fù)HIV感染者免疫功能，控制 HIV 感染者病程進(jìn)展起到積極作用，值得在臨床上進(jìn)一步觀察研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]史繼靜，劉朝奇PD-1及其配體PD-L在HIV感染中的作用[J]生命的化學(xué)，2010（30）：397-400

[2]趙慧，王亮，馬秀敏，等Tim-3及其配體Galectin-9與病毒感染的關(guān)系[J]基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2012，32（9）：1095-1098

[3]Day CL，Kaufmann DE，Kiepiela P，etalPD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progressionNature，2006，443（7109）：350-354

[4]Jones RB，Ndhlovu LC，Barbour JD，et alTim-3 expression defines a novel population of dysfunctional T cells with highly elevated frequeneiesin progressive HIV-1 infeetionJ Exp Med，2008，205（12）：2763-2779

[5]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS293-2008，艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標(biāo)準(zhǔn)

[6]中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥防治艾滋病研究中心和中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)艾滋病分會(huì)艾滋病中醫(yī)藥治療手冊(cè)[M]北京：中醫(yī)古籍出版社，2014：7-41