馬青青,劉建軍,余 鴿,劉 偉,馬亦生

1 西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院, 楊凌 712100 2 西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院, 楊凌 712100 3 陜西佛坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局, 佛坪 723400

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佛坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)秦嶺箭竹克隆結(jié)構(gòu)的SSR分析

馬青青1,劉建軍2,*,余 鴿1,劉 偉1,馬亦生3

1 西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院, 楊凌 712100 2 西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院, 楊凌 712100 3 陜西佛坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局, 佛坪 723400

利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了佛坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)秦嶺箭竹(Fargesiaqinlingensis)的克隆多樣性和克隆結(jié)構(gòu),以探討小尺度范圍內(nèi)秦嶺箭竹自然居群遺傳變異的分布特征,對(duì)該種開(kāi)花特性、高山地區(qū)生態(tài)環(huán)境維護(hù)和大熊貓的保護(hù)提供重要依據(jù)。結(jié)果表明7對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出79個(gè)位點(diǎn),其中多態(tài)性位點(diǎn)77個(gè),多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)為97.47%。秦嶺箭竹的142個(gè)分株共形成107個(gè)克隆,最大克隆可達(dá)5 m?？寺《鄻有月愿哂谄渌寺≈参锏钠骄?D=0.62,G/N=0.17,E=0.68),基因型比率(G/N)、Simpson指數(shù)(D)、平均克隆大小(N/G)和Fager均勻性指數(shù)(E)分別為0.7535、0.9680、1.3271和0.5109?？寺】臻g結(jié)構(gòu)分析表明秦嶺箭竹的克隆構(gòu)型為密集型,各克隆呈鑲嵌性分布,同一克隆的分株排列緊密?？寺【垲惙治霰砻鞲骺寺≈g聚類不明顯,總體上來(lái)自同一樣地的克隆被聚為一類?？臻g自相關(guān)分析顯示在空間距離為36 m范圍內(nèi),分株比基株有更顯著的空間遺傳結(jié)構(gòu),空間自相關(guān)系數(shù)r的取值范圍分別為0.084—0.626和0.024—0.288,說(shuō)明克隆繁殖在一定程度上限制了空間遺傳結(jié)構(gòu)的范圍。樣地內(nèi)秦嶺箭竹個(gè)體在空間距離小于44 m時(shí)存在顯著的正相關(guān)空間結(jié)構(gòu),特別是在4 m處表現(xiàn)出最大的空間自相關(guān)系數(shù)(r=0.626),表明空間距離相距4 m內(nèi)的個(gè)體最有可能屬于同一克隆,4 m比5 m更能表現(xiàn)出清晰的克隆結(jié)構(gòu),X-軸截距為52.280,代表了秦嶺箭竹不規(guī)則克隆的平均最小長(zhǎng)度。秦嶺箭竹的克隆多樣性和克隆結(jié)構(gòu)與初始苗補(bǔ)充、花粉散播方式和微環(huán)境差異有關(guān)。

秦嶺箭竹；克隆多樣性；克隆結(jié)構(gòu)；SSR

在被子植物中,克隆繁殖是一種極其普遍的繁殖方式[1],導(dǎo)致母本與親本產(chǎn)生相同的基因,對(duì)植物的遺傳結(jié)構(gòu)有重要影響[2]?？寺≈参锏目寺〈笮〖翱臻g分布結(jié)構(gòu)已經(jīng)成為克隆植物生態(tài)學(xué)和群體遺傳學(xué)研究的重要組成部分[3]。居群克隆多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的空間分布是物種長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中自然選擇等多種因素共同作用的結(jié)果,因此對(duì)克隆多樣性和克隆結(jié)構(gòu)的研究有助于了解各種進(jìn)化因素的作用[4]以及克隆植物的定居、侵殖和演替機(jī)理?？臻g自相關(guān)分析是研究小尺度范圍內(nèi)種群遺傳結(jié)構(gòu)的有效工具[5],已被廣泛的運(yùn)用于種群遺傳結(jié)構(gòu)領(lǐng)域中[6]。

秦嶺箭竹(Fargesiaqinlingensis)屬禾本科竹亞科箭竹屬,具有地下莖合軸叢生的克隆生長(zhǎng)方式[7],是一種典型的克隆植物[8]。秦嶺箭竹耐寒性強(qiáng),較耐干旱貧瘠土壤,在海拔2000 m上下有大面積純林,有的綿延數(shù)公里至數(shù)十公里[9],對(duì)水土保持、氣候調(diào)節(jié)和維護(hù)竹林野生動(dòng)物的生物多樣性等方面有重要的生態(tài)服務(wù)功能[10]。已有研究表明竹子以基株為單位開(kāi)花,基株交錯(cuò)或鑲嵌生長(zhǎng),開(kāi)花時(shí)間不同導(dǎo)致一片區(qū)域開(kāi)花時(shí)間可以持續(xù)好幾年[11-12],在沒(méi)有區(qū)分無(wú)性系分株間的遺傳結(jié)構(gòu)時(shí),不能確定竹林是否同時(shí)開(kāi)花。秦嶺箭竹是大熊貓夏季食物的主要來(lái)源[13],開(kāi)花周期一般為50a[14],其大面積開(kāi)花或死亡會(huì)直接造成大熊貓食物短缺。例如,1970年岷山缺苞箭竹和糙花箭竹的開(kāi)花事件就導(dǎo)致了138只大熊貓的死亡[15]。

為準(zhǔn)確了解竹類的遺傳結(jié)構(gòu),分子標(biāo)記法已經(jīng)被廣泛地運(yùn)用于竹類克隆多樣性和克隆結(jié)構(gòu)的研究中。如Suyama等通過(guò)AFLP分析了高山地帶日本矮竹Sasasenanensis的基株分布,發(fā)現(xiàn)在10hm2范圍內(nèi)至少有22個(gè)克隆,最大的克隆約有300 m,陡坡、巖石、溪流等微環(huán)境對(duì)克隆多樣性和克隆結(jié)構(gòu)都有較大影響[16]。Isagi等利用AFLP分子標(biāo)記法對(duì)同一個(gè)居群毛竹開(kāi)花前和開(kāi)花后的克隆結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)起源于上次開(kāi)花的不同的基株都有各自的開(kāi)花時(shí)間,開(kāi)花現(xiàn)象和克隆結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系以及小面積開(kāi)花都可能影響野生毛竹居群克隆的鑲嵌性結(jié)構(gòu)[17]。Franklin等通過(guò)SSR分子標(biāo)記對(duì)澳大利亞叢生竹Bambusaarnhemica進(jìn)行研究,推斷出：野外觀察到的一些野生的叢生竹類,一叢不只有一種克隆,而且生長(zhǎng)過(guò)于密集的分株會(huì)導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)的加劇[18]。Ma等利用AFLP分子標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)四川臥龍保護(hù)區(qū)內(nèi)小于30歲齡級(jí)和大于70歲齡級(jí)的兩個(gè)年齡段的冷箭竹Bashaniafangiana都是多克隆的,最大的克隆可達(dá)30m,克隆多樣性水平很高[19]。

目前對(duì)于秦嶺箭竹的研究主要集中在分類與分布、生物量、種子萌芽、幼苗生長(zhǎng)、葉片光譜特性變化、無(wú)性系構(gòu)件形態(tài)等方面[7,20-22],利用分子標(biāo)記法對(duì)其克隆多樣性和克隆結(jié)構(gòu)的研究還未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。SSR分子標(biāo)記法是生物學(xué)里最有效的遺傳標(biāo)記法之一,是由1—6個(gè)核苷酸為單位組成的多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列,這種序列廣泛地存在于真核生物中[23]。與其他分子標(biāo)記法相比,SSR分子標(biāo)記法表現(xiàn)出諸如PCR篩選過(guò)程簡(jiǎn)單、能夠提供相對(duì)豐富的潛在共顯性變異等優(yōu)點(diǎn)[24],被認(rèn)為是更適合用于遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記法[25],并且已經(jīng)被運(yùn)用于多種植物克隆多樣性和克隆結(jié)構(gòu)研究中[26-28]。因此本研究利用SSR分子標(biāo)記,旨在初步探討佛坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)秦嶺箭竹的克隆多樣性和克隆結(jié)構(gòu)及其形成原因,以期為該種開(kāi)花特性、高山地區(qū)生態(tài)環(huán)境維護(hù)和大熊貓的保護(hù)提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樣地設(shè)在佛坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)野豬蕩的山脊上,地理位置E107°50′40.4″、N33°41′50.2″,海拔2530 m左右,此處秦嶺箭竹密集地分布于巴山冷杉-牛皮樺混交林下。秦嶺箭竹地下莖合軸叢生,依據(jù)McClure以叢為單位分單株取樣的方法采集樣品[29]。為避免對(duì)某一叢竹子重復(fù)取樣,根據(jù)野外觀察到的每叢竹子大小確定取樣單株的最小間距為1 m。取樣分兩步進(jìn)行：第一步,設(shè)立5 m×5 m的兩個(gè)樣方a1、a2,以1 m×1 m為單位在交叉點(diǎn)上共取樣46個(gè)；第二步,為了得到清晰的克隆結(jié)構(gòu),設(shè)立兩個(gè)樣方A(30 m×10 m)、B(40 m×40 m),根據(jù)a1、a2實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終確定以5 m×5 m為單位在交叉點(diǎn)上取樣。兩個(gè)樣地由長(zhǎng)約120 m寬約40 m的裸露巖石帶阻隔,其中樣地A由a1、a2擴(kuò)大得到,共計(jì)取樣61個(gè),樣地B共取樣81個(gè)(圖1)。所有個(gè)體均經(jīng)GPS定位以做小尺度空間自相關(guān)分析。將所取新鮮幼嫩葉片放入裝有變色硅膠的塑封袋中于-80℃保存。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA的提取和檢測(cè)

用植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)并按試劑盒提供的流程提取秦嶺箭竹的總DNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA片段大小,用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度和濃度。所提取的DNA用ddH2O稀釋至50 ng/μL,于-20℃保存。

1.2.2 SSR引物設(shè)計(jì)和合成

從NCBI上下載箭竹屬的DNA序列信息(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),利用SSRHunter[30]軟件對(duì)所得序列進(jìn)行SSR搜索,選取二、三、四、五和六核苷酸重復(fù)基序長(zhǎng)度大于等于12 bp的序列,運(yùn)用OLIGO軟件設(shè)計(jì)引物,引物長(zhǎng)度為18—25 bp,擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期片段為130—400 bp。同時(shí)選取文獻(xiàn)中近緣物種的SSR引物(引物1和7)[31-32],共合成引物51對(duì)(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.2.3 SSR引物篩選和PCR擴(kuò)增

隨機(jī)選取4個(gè)樣品對(duì)上述合成的51對(duì)引物進(jìn)行首輪篩選,PCR產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。從剩下的樣品中隨機(jī)選取10個(gè)進(jìn)一步篩選擴(kuò)增條帶在目的片段內(nèi)的引物,用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物,共篩選出7對(duì)引物(表1)。

上述篩選的條件如下： PCR反應(yīng)體系為20 μL反應(yīng)體系,包括2 × PCR緩沖液、50 ng模板DNA、0.16 mmol/L dNTP、1.2 mmol/L Mg2 +、0.2 μmol/L引物和1.0 U Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)在美國(guó)Bio-RAD公司生產(chǎn)的MyCycler Thermal Cycler #170—9701EDU型PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min,各引物最佳退火溫度退火45 s,72 ℃延伸45 s,進(jìn)行30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸5 min后在4 ℃保存。將篩選出7對(duì)多態(tài)性好且穩(wěn)定的引物在ABI3730XL9(Applied Biosystems,USA)毛細(xì)管電泳儀上檢測(cè)所有樣品,用GeneMapper 4.0 (ABI, USA)軟件讀取擴(kuò)增片段大小。

圖1 秦嶺箭竹兩個(gè)樣方的克隆空間分布Fig.1 Clonal structure in two plots of Fargesia qinlingensis inferred from Simple Sequence Repeat (SSR) fingerprints數(shù)字代表兩個(gè)樣方所采的分株,共142個(gè)；相同基因型的分株用相同數(shù)字表示；橢圓圈定的是具有相同基因型的分株；虛線是對(duì)a1和a2樣方的放大

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

毛細(xì)管電泳得到的結(jié)果為擴(kuò)增產(chǎn)物的bp值,所有引物擴(kuò)增bp值相同的樣品為同一個(gè)基因型,將原始bp數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為0、1矩陣。

表1 7對(duì)SSR引物信息

運(yùn)用下列指數(shù)對(duì)克隆多樣性進(jìn)行分析[2]：

(1)平均克隆大小(N/G) 即所有樣本中基因型相同的為同一基株,G是居群中基株總數(shù),N是樣本總數(shù)。

(2)不同基因型比率(G/N)N為樣本大小,G為基株總數(shù)。

(3)Simpson多樣性指數(shù)(D) D=1-{[∑Ni(Ni-1)]/[N(N-1)]}

式中,Ni表示第i個(gè)基因型的總數(shù),N表示樣本大小。D從0到1變化,D為0表示整個(gè)居群是相同的基因型；D為1表示居群內(nèi)樣品的基因型各不相同。

(4)Fager指數(shù)(E)[33]表示種群內(nèi)不同基因型分布的均勻度。

E=(D-Dmin)/(Dmax-Dmin)

式中,Dmin=[(G-1)(2N-G)]/[N(N-1)],

Dmax=[N(G-1)]/[G(N-1)]

式中,E從0到1變化,E為0表示整個(gè)種群只有一個(gè)基因型或有一個(gè)基因型占據(jù)主要優(yōu)勢(shì)而其他基因型各包含一個(gè)樣品；E為1表示種群內(nèi)不同基因型有相同的樣本。

用POPGENE v1.31軟件[34]計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)和Nei′s遺傳距離。運(yùn)用PowerMaker 3.25[35]對(duì)所有基因型進(jìn)行UPGMA非加權(quán)算術(shù)平均聚類分析(Unweighted pair-group method analysis)。運(yùn)用GenAlEx 6.4[36]軟件計(jì)算秦嶺箭竹所有個(gè)體和克隆遺傳距離矩陣在相應(yīng)距離等級(jí)下(本研究中距離等級(jí)間相隔4 m)的空間自相關(guān)系數(shù)r,分析其小尺度克隆結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 秦嶺箭竹的克隆多樣性

利用篩選出的7對(duì)引物對(duì)秦嶺箭竹的142個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,共檢測(cè)到79個(gè)位點(diǎn),其中多態(tài)性位點(diǎn)77個(gè),多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)為97.47%,擴(kuò)增片段大小為135—279 bp。供試的142個(gè)秦嶺箭竹個(gè)體包含107個(gè)克隆(圖1),基因型比率(G/N)為0.7535,Simpson多樣性指數(shù)為0.9680,平均克隆大小(N/G)為1.3271,Fager均勻度指數(shù)(E)為0.5109,顯示出較高的克隆多樣性。

秦嶺箭竹居群的克隆空間分布見(jiàn)圖1。A、B兩個(gè)樣地均由多克隆組成,分別有30和77個(gè)克隆,并且沒(méi)有相同的基因型。在較小的取樣尺度(a1、a2,1 m×1 m)和較大的取樣尺度下(5 m×5 m)分別有16個(gè)和91個(gè)克隆?？寺?由25個(gè)分株組成,克隆9、30、43、102、106和107各由2個(gè)分株組成,克隆12包括6個(gè)分株,其余克隆都只有一個(gè)分株。秦嶺箭竹同一克隆的分株排列緊密(如克隆1和12),相鄰分株屬于同一克隆的可能性更大,各克隆呈鑲嵌性分布,為密集型構(gòu)型。

UPMGA對(duì)所有克隆聚類如圖2所示。各克隆之間聚類不明顯,表現(xiàn)出較高的遺傳相似性,總體上來(lái)自同一樣地的克隆被聚為一類,但樣地A的克隆5、18、19和23與樣地B的克隆71、39、75、96、107、33和104聚在一起,起源更為相似。

圖2 107個(gè)基因型UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA clustering based on dice genetic similarities calculated from SSR data between the 107 clones of Fargesia qinlingensis accessions 藍(lán)色的數(shù)字代表來(lái)自樣地A的克隆,黑色的數(shù)字代表來(lái)自樣地B的克隆

2.2 秦嶺箭竹克隆空間自相關(guān)分析

秦嶺箭竹居群所有分株和克隆的空間自相關(guān)分析結(jié)果如圖3所示。當(dāng)距離等級(jí)間隔為4 m時(shí),所有分株在空間距離小于44 m時(shí)存在顯著的正相關(guān)空間遺傳結(jié)構(gòu),存在聚集的格局,在56—116 m之間存在顯著的負(fù)相關(guān)空間遺傳結(jié)構(gòu),而在大于120 m時(shí)不存在顯著的空間遺傳結(jié)構(gòu),說(shuō)明個(gè)體在56 m外個(gè)體差別較大,X-軸截距為52.280,表示不規(guī)則克隆的平均大小,空間自相關(guān)系數(shù)r的取值范圍為0.084—0.626,在4 m處個(gè)體最為相似,表現(xiàn)出最大的正相關(guān)性(r=0.626)。所有克隆在空間距離小于36 m時(shí)表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)空間遺傳結(jié)構(gòu),在56—104 m之間存在顯著的負(fù)相關(guān)空間遺傳結(jié)構(gòu),而在36—56 m之間和108 m以外不存在顯著的空間遺傳結(jié)構(gòu),空間自相關(guān)系數(shù)r的取值范圍分別為0.024—0.288。

圖3 秦嶺箭竹居群所有個(gè)體和克隆空間自相關(guān)曲線圖Fig.3 Correlograms showing the spatial autocorrelation coefficient r of all individuals and clones with Fargesia qinlingensis populationr 為空間自相關(guān)系數(shù)；U和L分別表示不存在顯著性空間自相關(guān)遺傳結(jié)構(gòu)的95%置信區(qū)間的上限和下限

3 討論

本研究中秦嶺箭竹的Simpson多樣性指數(shù)(D)為0.9680,不同基因型比率(G/N)平均值為0.7535,高于Ellstrand和Roose[2]總結(jié)的克隆植物的平均值(D=0.62,G/N=0.17,E=0.68)表現(xiàn)出較高的克隆多樣性。Fager均勻度指數(shù)(E=0.5109)與之相比略低,說(shuō)明秦嶺箭竹居群內(nèi)基因型分布均勻度處于中等水平,每個(gè)克隆包含的分株數(shù)不完全相同。取樣策略(比如網(wǎng)格的規(guī)模和大小)和采樣個(gè)體的選擇都會(huì)影響秦嶺箭竹克隆多樣性水平。如Peng等對(duì)薔薇科植物(Ploylepisreticulate)的克隆多樣性研究發(fā)現(xiàn)較大取樣尺度比較小取樣尺度的克隆多樣性更高,克隆多樣性受取樣大小和空間范圍影響[37]。

克隆多樣性由基株的死亡和補(bǔ)充比率來(lái)確定[38],在最初定居后的短時(shí)期內(nèi)只有一些幼苗能夠存活下來(lái)以維持居群的克隆多樣性[39],隨之分株和基株間的競(jìng)爭(zhēng)排斥或死亡會(huì)導(dǎo)致克隆多樣性的降低[40],如果沒(méi)有種苗重復(fù)補(bǔ)充,基株就會(huì)急劇減少,最后導(dǎo)致幾個(gè)大的克隆的出現(xiàn)[41]。秦嶺箭竹無(wú)性繁殖期很長(zhǎng),大約每50a開(kāi)1次花結(jié)1次籽[14],因此在建群后發(fā)生實(shí)生苗補(bǔ)充的機(jī)率很低,此外,Ma等發(fā)現(xiàn)同為箭竹屬的冷箭竹(Bashaniafangiana)很可能是初始苗補(bǔ)充物種[19],據(jù)此推測(cè)初始苗補(bǔ)充對(duì)秦嶺箭竹的克隆多樣性有極大貢獻(xiàn)。

聚類分析表明來(lái)自同一樣地的克隆先聚在一起,但也有部分來(lái)自不同樣地的克隆被聚為一類,這可能是由于采樣點(diǎn)位于山脊,地勢(shì)開(kāi)闊平坦,在初期種苗補(bǔ)充時(shí),有利于風(fēng)力、動(dòng)物等傳播花粉或種子,從而使這些克隆有了更近的起源。

Lovett Doust把克隆植物的生長(zhǎng)型分為為游擊型和密集型,認(rèn)為典型的密集型物種,克隆鑲嵌分布而單個(gè)克隆中的分株緊密聚合；典型的游擊型物種,克隆混合生長(zhǎng)而單個(gè)克隆里的分株排列松散[42]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明秦嶺箭竹居群內(nèi)不同克隆鑲嵌分布,在較小的取樣尺度下(克隆1、12)單個(gè)克隆內(nèi)的分株緊密聚合,屬于密集型空間分布格局。這可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)恰好處于該地區(qū)箭竹人工造林較理想的生境,當(dāng)環(huán)境適宜、養(yǎng)分充足時(shí),秦嶺箭竹人工林表現(xiàn)為節(jié)間變短,隔離者長(zhǎng)度減小,分株增多[8],因此分株呈現(xiàn)出密集型克隆結(jié)構(gòu)。

微環(huán)境對(duì)克隆結(jié)構(gòu)有很大影響。Suyama 等對(duì)日本矮竹(Sasasenanensis)的克隆結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)在地勢(shì)平坦區(qū)域的克隆分布范圍較廣,大多數(shù)生長(zhǎng)在地勢(shì)陡峭區(qū)域的克隆生長(zhǎng)范圍受到限制,一個(gè)克隆只包含1個(gè)或2個(gè)分株[16]。Wang 等發(fā)現(xiàn)交錯(cuò)的巖石阻礙了華西箭竹(Fargesianitida)地下莖的延伸,在貧瘠的土壤里無(wú)法形成較為密集的種群[43]。根據(jù)野外觀測(cè),樣地A邊緣分布大片的裸露巖石,分布過(guò)于密集的巖石限制了秦嶺箭竹的生長(zhǎng)空間,種苗只能在較小的空間內(nèi)進(jìn)行無(wú)性繁殖,地下莖很難延展,無(wú)法形成較大克隆,加之秦嶺箭竹地下莖合軸叢生,因而此處出現(xiàn)了多個(gè)克隆(克隆1、2、3、6、7、8、9、10、11),而居群內(nèi)部障礙物較少,地下莖能有足夠的生長(zhǎng)空間,克隆1和克隆12有較多分株。此外,秦嶺箭竹在較小的取樣尺度下存在由單個(gè)分株組成的克隆,這可能是因?yàn)樵陂L(zhǎng)壽命的克隆植物中,體細(xì)胞突變是維持其遺傳變異的持續(xù)來(lái)源[2],可以使物種更好的適應(yīng)環(huán)境變化。李鈞敏等對(duì)小尺度范圍內(nèi)蛇莓(Duchesneaindica)克隆多樣性的研究也得到類似結(jié)果[44]。在較大尺度下大多數(shù)個(gè)體基因型各不相同,體現(xiàn)出取樣尺度對(duì)克隆結(jié)構(gòu)的影響。

物種遺傳變異的空間分布格局與繁育系統(tǒng)、花粉和種子散布方式等生殖生物學(xué)特性以及種群生境異質(zhì)性等有著密切聯(lián)系[45-46]?？臻g自相關(guān)分析表明,在36 m范圍內(nèi),可能是由于存在廣泛的克隆繁殖,分株比基株表現(xiàn)出更為顯著的正相關(guān)空間遺傳結(jié)構(gòu),反映出秦嶺箭竹呈密集型分布,在其他克隆植物的小尺度克隆結(jié)構(gòu)研究中也有類似結(jié)果[37,47],本研究以1 m×1 m為單位進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),以初步確定克隆大小,結(jié)果發(fā)現(xiàn)最大克隆為5 m,繼而以此為單位擴(kuò)大樣地以較大的樣本量驗(yàn)證秦嶺箭竹的最大克隆能否超過(guò)5 m,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)克隆都在5 m范圍內(nèi),而空間自相關(guān)分析表明所有分株在4 m處表現(xiàn)出最大的空間自相關(guān)系數(shù)(r=0.626),可能是因?yàn)闊o(wú)性繁殖可以導(dǎo)致短距離內(nèi)正的空間自相關(guān)[48],說(shuō)明相距4 m內(nèi)的個(gè)體最有可能屬于同一克隆,在以后的研究中可以以此為單位取樣,以便得到更清晰的克隆結(jié)構(gòu)。在1 m×1 m和5 m×5 m的取樣尺度下,秦嶺箭竹最大克隆分別包括25(克隆1)和2(克隆30、43、102、106、107)個(gè)分株,可見(jiàn)單個(gè)克隆在較小的取樣尺度下包含更多分株。正如Harada[49]的觀點(diǎn)：在一定范圍內(nèi)較小的取樣尺度更能清晰地闡明克隆結(jié)構(gòu),而過(guò)大的取樣尺度會(huì)錯(cuò)過(guò)小尺度的空間遺傳結(jié)構(gòu)。

竹子花粉較輕,無(wú)粘性,為風(fēng)媒傳粉植物[50],空曠的地帶有利于花粉和種子的長(zhǎng)距離擴(kuò)散。秦嶺箭竹野豬蕩居群位于山脊,地勢(shì)開(kāi)闊,有利于花粉和種子傳播到更遠(yuǎn)區(qū)域,但由于其開(kāi)花結(jié)籽周期很長(zhǎng),通過(guò)地下莖合軸叢生的方式進(jìn)行克隆繁殖的生長(zhǎng)習(xí)性占據(jù)了整個(gè)生命周期的絕大部分,因此克隆繁殖在一定程度上限制了空間遺傳結(jié)構(gòu)的范圍。

X-軸截距為52.280 m,代表了秦嶺箭竹不規(guī)則克隆的平均最小長(zhǎng)度,明顯小于沈曉婷得出的毛竹X-軸截距平均值63.36 m[51]。這可能是因?yàn)槊瘛坝螕粜汀睒?gòu)型的分株之間的距離可以很大,而秦嶺箭竹“密集型”克隆結(jié)構(gòu)的分株排列更為緊密,各基株呈鑲嵌性分布。綜上所述,秦嶺箭竹的克隆多樣性和克隆結(jié)構(gòu)與初始苗補(bǔ)充、花粉散播方式和微環(huán)境差異有關(guān)。本文僅用SSR分子標(biāo)記法初步探討了秦嶺箭竹的克隆多樣性和克隆結(jié)構(gòu),不同分子標(biāo)記法和不同取樣策略下的相關(guān)研究以及克隆結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化有待深入開(kāi)展。

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Clonal structure of aFargesiaqinlingensispopulation inferred using simple sequence repeat fingerprints in Foping National Nature Reserve

MA Qingqing1, LIU Jianjun2,*, YU Ge1,LIU Wei1, MA Yisheng3

1CollegeofForestry,NorthwestAgriculture&ForestryUniversity,Yangling712100,China2CollegeofLandscapeArchitectureandArts,NorthwestAgriculture&ForestryUniversity,Yangling712100,China3ShaanxiFopingNationalNatureReserve,Foping723400,China

The clonal diversity and clonal structure of aFargesiaqinlingensispopulation densely distributed in Foping National Nature Reserve were analyzed by simple sequence repeat (SSR) fingerprints. We aimed to describe how the clonal structure ofF.qinlingensiswas established at a small scale and its association with flowering traits, ecological environment conservation in high mountains, and the protection of giant pandas. In all, 81 SSR primers were designed, of which 7 pairs with good stability, high polymorphism, and specificity for our research were selected for the 142 sampled ramets. These 7 SSR primers generated a total of 79 valid loci, of which 77 (97.47%) were polymorphic. We successfully genotyped 107 clones among the 142 sampled ramets. The largest single clone may cover a spatial distance of approximately 5 m. This species showed a high clonal diversity, with the proportion of distinguishable genotypes (G/N), Simpson′s index of diversity (D), average size of genotypes (N/G), and Fager′s evenness (E) determined as 0.7535, 0.9680, 1.3271, and 0.5109, respectively. Its clonal diversity was slightly higher than the average diversity of other clonal plants, with a mean Simpson′s index of diversity (D) = 0.62, proportion of distinguishable genotypes (G/N) = 0.17, and Fager′s evenness (E) = 0.68. Analysis of clonal structure demonstrated that the spatial distribution pattern ofF.qinlingensisexhibited a phalanx growth strategy at the ramet level, in contrast with our results that showed ramets belonging to the same clone were closely aggregated and formed distinct clumps at the 1 m × 1 m sample scale and clones were juxtaposed at the 5 m × 5 m sample scale. Although unweighted pair-group method analysis (UPGMA) demonstrated no distinct clusters of clones, the clones in the same plot were always classified into the same clade. Spatial autocorrelation analysis showed the spatial autocorrelation coefficientsrwere 0.084—0.626 and 0.024—0.288 at the ramet and genet levels, respectively. This result indicated a significantly stronger spatial autocorrelation at the ramet level than at the genet level forF.qinlingensiswithin a spatial distance of 36 m, which implied that in spite of pollen flow might extend the spatial genetic structure, clonal propagation made a certain restriction of the spatial genetic structure. The autocorrelation coefficient was significantly positive within the distance of 44 m at the ramet level and theX-intercept representing the average minimum length of irregular clone was 52.280 m. In addition, the largest spatial autocorrelation coefficient was 0.626 at 4 m, which suggested that ramets within 4 m most likely belonged to the same clone. It also implies that a sampling scale of 4 m shows a more distinct clonal structure than that of 5 m. Furthermore, we detected significant negative autocorrelation from 56 m to 116 m, but no significantr-values were detected beyond 120 m. At the genet level, the autocorrelation coefficient was significantly positive within the distance of 36 m, significantly negative from 56 m to 104 m, but showed no significant autocorrelation from 36 m to 56 m, and beyond 108 m. Our results revealed that clonal diversity and clonal structure could be affected by initial seeding recruitment, pollen dispersal, and heterogeneity of microenvironment. A relatively larger sample size and a more reasonable sample strategy would be favorable to investigate a more distinct clonal structure and clonal diversity ofF.qinlingensisin different habitats.

Fargesiaqinlingensis; clonal diversity; clonal structure; SSR

國(guó)家林業(yè)局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(200904004)

2015- 03- 07;

日期:2016- 01- 22

10.5846/stxb201503070443

*通訊作者Corresponding author.E-mail: ljj@nwsuaf.edu.cn

馬青青,劉建軍,余鴿,劉偉,馬亦生.佛坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)秦嶺箭竹克隆結(jié)構(gòu)的SSR分析.生態(tài)學(xué)報(bào),2016,36(20):6496- 6505.

Ma Q Q, Liu J J, Yu G,Liu W, Ma Y S.Clonal structure of aFargesiaqinlingensispopulation inferred using simple sequence repeat fingerprints in Foping National Nature Reserve.Acta Ecologica Sinica,2016,36(20):6496- 6505.