劉 星, 張文明, 張春紅, 邱慧珍,*, 李瑞琴, 王 蒂, 沈其榮

1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730070 2 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所, 蘭州 730070 3 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 蘭州 730070 4 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 南京 210095

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土壤滅菌-生物有機(jī)肥聯(lián)用對連作馬鈴薯及土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

劉 星1, 張文明1, 張春紅1, 邱慧珍1,*, 李瑞琴2, 王 蒂3, 沈其榮4

1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730070 2 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所, 蘭州 730070 3 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 蘭州 730070 4 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 南京 210095

甘肅省中部沿黃灌區(qū)是全國重要的加工型馬鈴薯生產(chǎn)基地, 然而因集約化生產(chǎn)帶來的連作障礙問題已經(jīng)嚴(yán)重影響到當(dāng)?shù)伛R鈴薯種植業(yè)的健康發(fā)展。結(jié)合田間試驗(yàn)和相關(guān)的室內(nèi)分析, 從馬鈴薯塊莖產(chǎn)量和品質(zhì)、植株生理特征和土壤真菌群落結(jié)構(gòu)等角度, 初步評估土壤滅菌和生物有機(jī)肥聯(lián)用(Ammonia Disinfection plus Bio-organic Fertilizer Regulation, ABR)對馬鈴薯連作障礙的防控效果。同對照相比, ABR處理的塊莖產(chǎn)量和商品薯率分別顯著增加約71.1%—152.1%和39.2%—53.3%, 但塊莖化學(xué)品質(zhì)變化不大。ABR處理葉綠素含量和根系活力較CK均顯著增加, 而葉片和根系丙二醛含量顯著下降。PCR-DGGE分析發(fā)現(xiàn), ABR處理顯著影響了馬鈴薯連作土壤的真菌群落結(jié)構(gòu), 表現(xiàn)為真菌群落的多樣性指數(shù)較CK相比顯著下降。ABR處理還有效抑制了土傳病害的滋生, 植株發(fā)病率和收獲后的病薯率較CK分別顯著下降約67.2%—82.2%和69.1%—70.5%。采用Real-time PCR評估連作土壤中3種優(yōu)勢致病真菌的數(shù)量變化, 顯示ABR處理下立枯絲核菌、茄病鐮刀菌和接骨木鐮刀菌的數(shù)量在生育期內(nèi)較CK均有不同程度的下降。綜合來看, 土壤滅菌和生物有機(jī)肥聯(lián)用技術(shù)在防控甘肅省中部沿黃灌區(qū)馬鈴薯連作障礙上具有較大的應(yīng)用潛力, 而對土傳病害的抑制和微生物群落結(jié)構(gòu)的改善是其主要的作用機(jī)理。

馬鈴薯; 連作; 生物有機(jī)肥; 土壤滅菌; 土傳病害

馬鈴薯是甘肅省的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè), 同時(shí)也是促進(jìn)當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收的主要渠道和重要的糧食來源。根據(jù)區(qū)域化生產(chǎn)和專業(yè)化布局的統(tǒng)一規(guī)劃, 甘肅中部沿黃灌區(qū)被定位為西北地區(qū)加工型馬鈴薯的主要生產(chǎn)基地和種薯繁殖基地。但規(guī)模化和集約化的栽培實(shí)踐以及農(nóng)業(yè)訂單為導(dǎo)向的生產(chǎn)模式造成馬鈴薯多年連作, 導(dǎo)致植株生長發(fā)育受阻, 塊莖產(chǎn)量和品質(zhì)下降, 土傳病害猖獗等一系列問題, 嚴(yán)重影響企業(yè)的種植效益, 危害馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因而在探明馬鈴薯連作障礙機(jī)理的基礎(chǔ)上, 尋求能夠緩解或克服連作障礙的有效措施對于促進(jìn)該地區(qū)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分, 其在結(jié)構(gòu)和功能上具有高度的多樣性, 驅(qū)動著能量傳遞、養(yǎng)分循環(huán)、礦質(zhì)化和腐殖化、以及污染物的降解等土壤重要的生化過程。長期連作種植條件下產(chǎn)生的作物生產(chǎn)力下降問題通常與土壤微生物因子的變化息息相關(guān)[1- 2]。連作能夠引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著變化, 使得土壤從抑病型向?qū)Р⌒偷姆较蜣D(zhuǎn)變, 土傳病害滋生, 作物長勢變差并且大幅度地降低農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量, 而這其中大部分是真菌型的土傳病害[3- 8]?；谄桨迮囵B(yǎng)并結(jié)合PCR-DGGE、Real-time PCR和高通量測序等分子生物學(xué)方法, 早前的研究結(jié)果也顯示, 馬鈴薯連作導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)顯著改變, 病原菌過渡成為優(yōu)勢種群,Rhizoctoniasolani和Fusariumsp.等土傳病原真菌的數(shù)量顯著增加, 導(dǎo)致病害大面積發(fā)生, 塊莖產(chǎn)量降低[9- 15]。在國內(nèi)外的連作障礙防控研究中, 病原菌的合理有效抑制是首要考慮的科學(xué)問題。健康的微生物區(qū)系是高產(chǎn)高效土壤的重要特征, 同時(shí)對土傳病害的抑制具有積極作用, 因此修復(fù)和重建連作土壤健康的微生物區(qū)系并使之朝著具有自主抑病能力的方向轉(zhuǎn)變同樣十分關(guān)鍵[16-19]。土壤滅菌的方法在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用來抑制病原菌, 但這類方法通常未能夠照顧到連作土壤微生物區(qū)系的修復(fù)和重建問題。除存在生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)外, 甲基溴和三氯硝基甲烷等強(qiáng)力型化學(xué)滅菌劑的使用也使得土壤中的非靶標(biāo)微生物類群同樣受到破壞性的影響, 微生物群落結(jié)構(gòu)改變, 土壤酶活性顯著下降, 這不利于土壤可持續(xù)生產(chǎn)力的維持[20- 23]。僅通過播前土壤滅菌盡管能夠在短期內(nèi)抑制或消除大部分的微生物, 但從生態(tài)學(xué)角度看, 滅菌完成后土壤中殘存的病原微生物會在近似于無限養(yǎng)分和低強(qiáng)度競爭的土壤介質(zhì)中重新生長繁殖, 致病菌數(shù)量反彈[24- 28]。因而發(fā)展可行的替代方法來抑制土傳病害并進(jìn)行有效地土壤微生物區(qū)系調(diào)控已成為研究的熱點(diǎn)[19]。也有學(xué)者從施用生物有機(jī)肥的角度, 通過外源微生物和有機(jī)碳的輸入來進(jìn)行土壤改良進(jìn)而克服連作障礙, 但這類實(shí)踐仍然存在較多的爭議且效果并不穩(wěn)定[19,29]。本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果也顯示, 在長期連作條件下, 單獨(dú)的生物有機(jī)肥施用并不能有效緩解馬鈴薯連作障礙, 減少塊莖產(chǎn)量損失。生物有機(jī)肥雖然能夠降低病害的發(fā)生, 但是對于病害嚴(yán)重的長年連作土壤, 其防治效果仍不能將病原菌控制在不發(fā)病或不會引起重大經(jīng)濟(jì)損失的閾值范圍內(nèi)[29]。本研究采取連作土壤播前病原菌抑制和播后土壤微生物區(qū)系改良并重的策略, 即在馬鈴薯播前進(jìn)行土壤滅菌, 而后在馬鈴薯生長發(fā)育過程中將生物有機(jī)肥直接兌水澆灌于植株根際, 增加有益菌和拮抗菌向馬鈴薯根際的輸入, 試圖通過此方法來達(dá)到病原菌的持續(xù)性抑制和人工改善連作馬鈴薯根際微生態(tài)環(huán)境的目的, 進(jìn)而緩解或克服馬鈴薯連作障礙。結(jié)合田間試驗(yàn)和相關(guān)室內(nèi)分析, 本研究初步評估土壤滅菌和生物有機(jī)肥聯(lián)用對甘肅省中部沿黃灌區(qū)馬鈴薯連作障礙的防控效果, 特別是該方法對長期連作條件下馬鈴薯塊莖產(chǎn)量和品質(zhì), 植株生理生態(tài)特征, 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和病原菌數(shù)量, 以及植株發(fā)病率的影響, 以期探索能夠緩解或克服連作障礙的有效措施, 為該地區(qū)馬鈴薯生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

田間試驗(yàn)設(shè)置在地處甘肅省中部沿黃灌區(qū)的白銀市景泰縣, 當(dāng)?shù)赜谐渥愕乃春土己玫霓r(nóng)業(yè)灌溉條件。地理坐標(biāo)處于103°33′—104°43′ E, 36°43′—37°38′ N之間, 境內(nèi)平均海拔約1500 m, 屬溫帶大陸干旱氣候, 年平均氣溫為9.1 ℃, 無霜期在141 d左右。年平均降水量為185.6 mm, 年平均蒸發(fā)量為1722.8 mm。年平均日照時(shí)數(shù)2713 h, 全縣光熱資源豐富,日照百分率62%, 年平均輻射量618.3952kJ/m2, ≥0℃的年活動積溫為3614.8 ℃, ≥10℃的年有效積溫為3038 ℃, 是我國除青藏高原外光熱資源最豐富的地區(qū)之一。供試土壤為灰鈣土, 質(zhì)地為砂壤。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

田間試驗(yàn)于2011年在景泰縣條山農(nóng)場進(jìn)行?；谠囼?yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性考慮, 同時(shí)選擇連作年限為5a和6a的馬鈴薯種植地塊進(jìn)行田間試驗(yàn)(分別以CP5和CP6表示)。供試地塊在2010年的塊莖產(chǎn)量僅有農(nóng)場平均產(chǎn)量的20%—25%, 屬連作障礙重度地塊, 土傳病害發(fā)病嚴(yán)重。滅菌處理前采集供試地塊耕層土壤樣品, 基礎(chǔ)農(nóng)化性狀見表1。田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)為：對照(CK)和土壤滅菌-生物有機(jī)肥聯(lián)用處理(Ammonia Disinfection plus Bio-organic Fertilizer Regulation, ABR)。3次重復(fù), 隨機(jī)區(qū)組排列, 小區(qū)面積為54 m2(5.4 m×10 m)。采用統(tǒng)一的馬鈴薯栽培模式和施肥量, 寬壟雙行, 覆膜種植, 播種前一天切種薯, 并用濃度為1.5%的高錳酸鉀溶液消毒, 壟寬和行距分別為1.35 m和 0.30 m, 株距為0.17m, 種植密度約為5605株/667m2。聯(lián)用處理和對照均采用相同的化肥用量, 氮肥為210kg N/hm2, N∶P2O5∶K2O比例為1.4∶1.0∶2.0, 化肥分別用養(yǎng)分含量為15- 15- 15的復(fù)合肥和含N 46%的尿素以及含K2O 51%的硫酸鉀。播種和施肥過程機(jī)械化同步進(jìn)行, 人工覆膜?；试诓シN時(shí)一次性基施, 無追肥, 其余栽培和灌溉以及田間管理措施均按農(nóng)場統(tǒng)一方法進(jìn)行。當(dāng)年5月28日播種, 9月16日收獲。供試材料為當(dāng)?shù)刂髟缘募庸ば婉R鈴薯品種“大西洋”, 由條山農(nóng)場提供。

土壤滅菌在馬鈴薯播種前一個半月進(jìn)行, 具體操作如下：將半腐熟玉米秸稈平鋪至處理小區(qū), 氨水均勻?yàn)⒌浇斩挶砻? 然后快速地將秸稈人工翻埋, 深度為0—20cm, 再用水澆灌使上層土壤達(dá)到飽和, 最后使用雙層地膜覆蓋整個小區(qū), 四周用土壓實(shí)密閉防止氨揮發(fā)和風(fēng)吹。土壤滅菌持續(xù)1個月時(shí)間, 而后揭膜晾曬7天, 使氨完全揮發(fā), 最后采集少量滅菌后土壤進(jìn)行室內(nèi)發(fā)芽試驗(yàn), 以保證馬鈴薯正常出苗。市售氨水的用量為130L/667m2,秸稈的用量為3m3/667m2。

在馬鈴薯出苗后每間隔20 d左右進(jìn)行生物有機(jī)肥的澆灌, 全生育期共澆灌3次。捅破地膜后輕輕扒開馬鈴薯植株莖基部周圍表土, 用兌水后攪拌均勻的生物有機(jī)肥懸濁液直接沿植株莖基部澆灌, 澆灌完成后將土壤回填并重新蓋上地膜, 膜上覆土并用手壓平壟面。生物有機(jī)肥的澆灌濃度為2%(w/v), 每株馬鈴薯單次的澆灌量為0.5 kg。對照小區(qū)植株澆灌等量清水。生物有機(jī)肥由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物營養(yǎng)系提供, 有機(jī)質(zhì)含量為56.4%, 全氮含量為2.0%, 其中氨基酸態(tài)氮占總氮的60%以上, P2O5含量為3.7%, K2O含量為 1.1%, 含根際促生細(xì)菌和抗土傳病害功能菌數(shù)量大于108cfu/g, 拮抗型微生物菌種為Bacillussubtillis和Trichodermasp.。

表1 供試土壤的基礎(chǔ)農(nóng)化性質(zhì)

表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

1.3 樣品采集與分析

根據(jù)生育時(shí)期, 分別在馬鈴薯播前(即土壤滅菌結(jié)束后)、苗期、塊莖膨大期、淀粉積累期和收獲期采用五點(diǎn)取樣法采集土樣, 采樣均在壟上馬鈴薯行間靠近植株根系處進(jìn)行, 且避開生物有機(jī)肥澆灌時(shí)間, 采樣深度為0—20 cm。將每個小區(qū)的土壤樣品混合均勻后, 密封貯存于-80 ℃冰箱中待提取土壤DNA。馬鈴薯收獲時(shí)在每個小區(qū)隨機(jī)選擇健壯程度和長勢一致的無病害植株10株, 使用鐵鍬在盡量不破壞根系的前提下將植株整株挖出, 用清水將根系緩緩沖洗干凈, 調(diào)查農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量構(gòu)成要素后, 將植株分根、莖、葉和塊莖四部分帶回實(shí)驗(yàn)室, 105 ℃下殺青30 min, 80 ℃烘至恒重, 稱量干物質(zhì), 并計(jì)算根冠比和收獲指數(shù)。各個試驗(yàn)小區(qū)馬鈴薯塊莖進(jìn)行實(shí)收計(jì)產(chǎn), 并對薯塊進(jìn)行分級, 調(diào)查商品薯率、病薯率和畸形薯率。同時(shí)在每一個小區(qū)內(nèi)選取大小相近的無病害塊莖20個, 帶回實(shí)驗(yàn)室制備混合鮮樣后進(jìn)行化學(xué)品質(zhì)指標(biāo)的測定。

連作馬鈴薯植株的生理特征調(diào)查在塊莖膨大期和淀粉積累期進(jìn)行。在每個試驗(yàn)小區(qū)選取長勢中庸且無明顯病癥的馬鈴薯植株5株, 測定其主莖頂枝第3和第4片完全展開葉的葉綠素含量, 而后使用鐵鍬將植株帶土挖出并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室, 剪下葉片和根系部分用于測定相關(guān)的生理指標(biāo)。采用SPAD值來表征葉綠素含量, SPAD 502型葉綠素儀測定, 多次重復(fù)并求取平均值; 葉片和根系的丙二醛含量采用硫代巴比妥酸(Thiobarbituric Acid, TBA)顯色法測定; 根系活力采用氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazolium Chloride, TTC)法測定[30]。各試驗(yàn)小區(qū)馬鈴薯植株病害的發(fā)生情況采用病薯率和植株發(fā)病率共同表示, 病薯率在收獲時(shí)通過調(diào)查薯塊分級計(jì)算, 植株發(fā)病率調(diào)查分別在塊莖膨大期、淀粉積累期和收獲期進(jìn)行。由于試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)馬鈴薯病害主要為土傳病害, 因此在植株發(fā)病率調(diào)查過程中未詳細(xì)區(qū)分病害種類。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)評估土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。采用Power SoilTMDNA Isolation kit(MoBio laboratories, USA)提取土壤微生物總DNA, 稱取0.25 g混勻的土壤樣品裝入提取柱中, 按說明書上的操作步驟提取100 μL土壤DNA, 1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA提取效果檢測, 提取的微生物DNA總量約為23 Kb。真菌PCR反應(yīng)采用18S rDNA特異性通用引物GC-Fungi(含GC夾)和NS- 1[31]。PCR反應(yīng)體系：1 μL的模板, 2 μL dNTPs(2mmol/L), 2.5 μL 10× PCR-buffer, 2.5 μL Mg2+(25mmol/L), 0.3 μL Taq DNA polymerase,引物各0.5 μL, ddH2O為15.7 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min, 然后94 ℃變性45 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 32個循環(huán), 最后72 ℃延伸5 min, 10 ℃保溫。使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測, 真菌DNA的PCR產(chǎn)物片段長度在370 bp左右。聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%, 變性梯度為25%—40%, PCR產(chǎn)物在D-Code DGGETM系統(tǒng)(Bio-Rad)中進(jìn)行電泳, 條件為80 V, 恒溫60 ℃, 在1× TAE中電泳16 h。電泳結(jié)束后銀染, 膠片用Win RHIZOTM掃描系統(tǒng)成像。膠圖的譜帶分析采用凝膠定量軟件Quantity One進(jìn)行。真菌群落的多樣性指數(shù)的計(jì)算基于DGGE條帶的位置和條帶的強(qiáng)度：H=-∑PilnPi=-∑(ni/N)ln(ni/N)，式中ni為DGGE泳道第i條泳帶亮度峰值高度,N為泳道中所有泳帶亮度峰值高度總和[32]。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)的方法評估土壤中3種真菌致病菌的數(shù)量動態(tài)變化, 分別是立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani), 茄病鐮刀菌(Fusarinmsolani)和接骨木鐮刀菌(Fusariumsambucinum), 標(biāo)準(zhǔn)菌株由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植保系和甘肅省農(nóng)科院植保所提供。供試菌株在液體培養(yǎng)基中25 ℃搖動培養(yǎng)3—5 d后, 收集菌絲團(tuán), 提取DNA。3種病原菌rDNA-ITS序列PCR擴(kuò)增的特異性引物和反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件同早前的文獻(xiàn)報(bào)道[12-13]。熒光定量PCR采用ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行, 擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL：2× SYBR?Premix Ex TaqTM混合液10 μL, 引物各0.4 μL, 50× Rox Reference Dye II 0.4 μL, DNA模板2 μL, 超純水6.8 μL。擴(kuò)增的反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s, 然后95 ℃變性5 s, 60 ℃退火34 s,40個循環(huán)。在每一循環(huán)的退火階段收集熒光, 實(shí)時(shí)檢測反應(yīng)并且記錄熒光信號變化, 得出擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線。將病原菌特異引物擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物純化, 連接至PUC18T載體上, 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中, 挑取轉(zhuǎn)化后平板上的白色單克隆提取質(zhì)粒DNA, 測序確定插入片段是否正確。在1.0×10-8至1.0×10-3的質(zhì)粒濃度范圍內(nèi)選擇6個模板梯度進(jìn)行反應(yīng), 確定閾值和基線, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 橫坐標(biāo)為病原菌拷貝數(shù)的常用對數(shù), 縱坐標(biāo)為熒光定量PCR測得的Ct值。立枯絲核菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.2330x+32.984,R2=0.9990; 茄病鐮刀菌為y=-3.4925x+36.688,R2=0.9994; 接骨木鐮刀菌為y=-3.4901x+34.811,R2=0.9978。通過Ct值, 計(jì)算待測樣品中病原菌的數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

田間試驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算和圖表繪制在Microsoft Excel 2007軟件上進(jìn)行。使用DPS軟件進(jìn)行處理間差異的顯著性檢驗(yàn)(One-way,P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤滅菌-生物有機(jī)肥聯(lián)用對連作馬鈴薯產(chǎn)量品質(zhì)和農(nóng)藝性狀的影響

ABR處理塊莖產(chǎn)量較CK在CP5和CP6地塊分別顯著增加約152.11%和71.13%(表2)。處理間在單株結(jié)薯數(shù)量上并無顯著差異, 但在單株產(chǎn)量和單薯重量上差異明顯。兩個地塊上, ABR處理單株產(chǎn)量較CK分別顯著增加約70.89%和77.75%, 單薯重量也分別增加約81.49%和108.11%。從產(chǎn)量構(gòu)成看, 單薯重量大幅增加是ABR處理下連作馬鈴薯塊莖產(chǎn)量增加的直接原因。ABR處理較CK相比株高有顯著增加, 兩個地塊上增幅分別約為10.62%和26.20%。但在植株莖圍、分株數(shù)和主莖分枝數(shù)上, ABR處理和CK并無顯著差異。

土壤滅菌和生物有機(jī)肥聯(lián)用顯著改善連作馬鈴薯植株生產(chǎn)力(表3),ABR處理整株生物量較CK在兩個地塊下分別顯著增加約36.99%和45.20%。就植株各器官而言, ABR處理下莖、葉和塊莖的生物量較CK在兩個供試地塊下均有不同程度的顯著增加。ABR處理較CK還顯著降低植株根冠比, CP5和CP6地塊上分別降低約30.36%和36.18%。統(tǒng)計(jì)分析表明, 根冠比與塊莖產(chǎn)量(R2=-0.5153,P=0.0086,n=12)和單株產(chǎn)量(R2=-0.4129,P=0.0242,n=12)均有著顯著或極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。ABR處理和CK在收獲指數(shù)上無顯著性差異。

表2 馬鈴薯塊莖產(chǎn)量及其產(chǎn)量構(gòu)成要素和植株農(nóng)藝性狀的比較

CK: 對照; ABR: 土壤滅菌-生物有機(jī)肥聯(lián)用;表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差, 同列的不同小寫字母表示相同地塊下處理間差異達(dá)5%顯著水平(P0.05)

表3 馬鈴薯整株和不同器官生物量的比較

收獲后馬鈴薯塊莖品質(zhì)的分析結(jié)果見表4。整體來看, 土壤滅菌和生物有機(jī)肥聯(lián)用對塊莖品質(zhì)影響較小, 反映在對加工型馬鈴薯最為重要的淀粉和還原糖含量上。兩個供試地塊上, ABR處理與CK的淀粉和還原糖含量均無顯著差異; 在可溶性總糖含量上, ABR處理較CK分別顯著下降約10.30%和12.24%。但在還原型維生素C含量上, ABR處理較CK分別顯著增加約67.17%和10.95%。ABR處理的可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量較CK在兩個地塊下均未顯示出一致的變化特征。

2.2 土壤滅菌-生物有機(jī)肥聯(lián)用對連作馬鈴薯商品薯率和發(fā)病情況的影響

土壤滅菌和生物有機(jī)肥聯(lián)用能夠顯著提高連作馬鈴薯的商品薯率(表5)。在CP5和CP6地塊上, ABR處理商品薯率較CK分別顯著增加約39.15%和53.25%; 而病薯率相比于CK則分別顯著下降約69.05%和70.52%。另外, 土壤滅菌和生物有機(jī)肥聯(lián)用也大幅降低連作馬鈴薯植株發(fā)病率, 不同生育時(shí)期下ABR處理較CK下降約67.23%—76.90%(CP5地塊)和74.39%—82.20%(CP6地塊)。相關(guān)分析結(jié)果表明, 塊莖產(chǎn)量與病薯率(R2=-0.5999,P=0.0031,n=12)和不同生育時(shí)期下植株發(fā)病率(R2=-0.5697—0.6044,P=0.0029—0.0045,n=12)之間均有著極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。

表4 收獲后馬鈴薯塊莖化學(xué)品質(zhì)的比較

表5 馬鈴薯商品薯率、病薯率和植株發(fā)病率的比較

2.3 土壤滅菌-生物有機(jī)肥聯(lián)用對連作馬鈴薯植株生理特征的影響

由圖1可知, 土壤滅菌和生物有機(jī)肥聯(lián)用能夠顯著影響連作馬鈴薯植株生理特征。在CP5地塊上, ABR處理的葉綠素含量較CK在塊莖膨大和淀粉積累期分別顯著增加約9.36%和7.27%; 在CP6地塊上, 兩個生育時(shí)期也分別顯著增加約7.27%和11.17%。同時(shí), 兩個地塊下, 不同生育時(shí)期內(nèi)ABR處理較CK均顯著提高連作馬鈴薯植株的根系活力。此外, ABR處理下植株葉片和根系的丙二醛含量較CK均顯著降低, 其中以根系降幅最大, 約為62.32%—67.53%。

圖1 土壤滅菌-生物有機(jī)肥聯(lián)用對連作馬鈴薯植株生理特征的影響Fig.1 Effects of combination application of soil disinfection and bio-organic fertilizer amendment on physiological characteristics of potato plants in monoculture systemTBS：塊莖膨大期 tuber bulking stage；SAS：淀粉積累期 starch accumulation stage；圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3), 不同小寫字母表示相同供試地塊下處理間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)

2.4 土壤滅菌-生物有機(jī)肥聯(lián)用對連作土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

應(yīng)用變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)分離真菌18S rDNA片段的PCR產(chǎn)物, 不同DNA片段遷移為若干條帶。整體來看, 土壤滅菌和生物有機(jī)肥聯(lián)用處理改變了馬鈴薯連作土壤的真菌群落結(jié)構(gòu), 這從DGGE圖譜的條帶數(shù)量和相關(guān)條帶的明暗程度上均能體現(xiàn)(圖2)。進(jìn)一步通過計(jì)算多樣性指數(shù)來定量化描述連作土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化(圖3)。滅菌降低連作土壤真菌群落的多樣性, 表現(xiàn)在ABR處理下播前土壤真菌群落的多樣性指數(shù)較CK在兩個供試地塊上均顯著下降, 這是由于真菌病原菌受到抑制所致。但在馬鈴薯苗期, CP5地塊上ABR處理和CK間多樣性指數(shù)卻并未表現(xiàn)出顯著差異, 這可能與土壤滅菌結(jié)束后短期內(nèi)連作土壤殘存真菌重新生長繁殖有關(guān), 而在馬鈴薯播種過程中因耕作所帶來的土壤擾動和施肥也有利于這種真菌群落的快速恢復(fù)。在CP5地塊上, 隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)并伴隨著生物有機(jī)肥的澆灌, ABR處理的真菌群落多樣性指數(shù)逐漸下降, 而CK則變化不大, 表現(xiàn)在塊莖膨大期和淀粉積累期, ABR處理多樣性指數(shù)較CK分別顯著下降約11.68%和24.68%, 這種處理間差異直至收獲期消失。而就CP6地塊來看, ARR處理和CK的真菌群落多樣性指數(shù)變化趨勢與CP5地塊整體一致, 只是變化程度略有不同。統(tǒng)計(jì)分析表明, 在塊莖膨大期和淀粉積累期, 連作土壤真菌群落的多樣性指數(shù)與植株發(fā)病率之間有著極顯著的正相關(guān)關(guān)系(R2=0.5385,P<0.0001,n=24)。

圖3 土壤滅菌-生物有機(jī)肥聯(lián)用對馬鈴薯連作土壤真菌群落多樣性的影響Fig.3 Effects of combination application of soil disinfection and bio-organic fertilizer amendment on diversity index of soil fungal community in potato monoculture systemBS：播前 before sowing; SS：苗期 seedling stage；TBS：塊莖膨大期 tuber bulking stage；SAS：淀粉積累期 starch accumulation stage；HT：收獲期 harvest stage

2.5 土壤滅菌-生物有機(jī)肥聯(lián)用對馬鈴薯連作土壤致病菌數(shù)量的影響

圖4 土壤滅菌-生物有機(jī)肥聯(lián)用對馬鈴薯連作土壤真菌致病菌數(shù)量的影響Fig.4 Effects of combination application of soil disinfection and bio-organic fertilizer amendment on the numbers of fungal pathogens in soils in potato monoculture system

馬鈴薯連作土壤中3種真菌致病菌數(shù)量的動態(tài)變化見圖4。可以看出, 土壤滅菌和生物有機(jī)肥聯(lián)用能夠顯著抑制土傳真菌致病菌數(shù)量。在CP5地塊上, ABR處理立枯絲核菌的數(shù)量在播前、苗期、淀粉積累期和收獲期較CK相比顯著下降約30.35%—60.40%; 而在塊莖膨大期, 盡管也表現(xiàn)為ABR處理低于CK, 但并未達(dá)到差異顯著水平。在CP6地塊上, ABR處理和CK土壤立枯絲核菌數(shù)量的變化趨勢與CP5地塊表現(xiàn)一致。此外, ABR處理較CK也顯著降低整個生育期內(nèi)接骨木鐮刀菌和茄病鐮刀菌的數(shù)量, 且不同供試地塊表現(xiàn)基本一致。土壤致病菌數(shù)量的顯著下降是連作系統(tǒng)下馬鈴薯植株發(fā)病率和病薯率下降的直接原因, 相關(guān)分析結(jié)果證明, 3種致病菌數(shù)量與植株發(fā)病率間均有著極顯著的正相關(guān)關(guān)系(R2=0.2000—0.4113,P<0.01,n=36), 且立枯絲核菌(R2=0.4726,P=0.0135,n=12)和接骨木鐮刀菌數(shù)量(R2=0.3862,P=0.0310,n=12)與病薯率之間也均有著顯著的正相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論與討論

3.1 土壤滅菌-生物有機(jī)肥聯(lián)用能夠有效緩解馬鈴薯連作障礙

集約化生產(chǎn)實(shí)踐和訂單農(nóng)業(yè)種植模式導(dǎo)致甘肅省中部沿黃灌區(qū)出現(xiàn)嚴(yán)重的馬鈴薯連作障礙問題, 危害馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。隨著馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的實(shí)施, 發(fā)展高效的馬鈴薯連作障礙防控技術(shù)也愈發(fā)緊迫。目前, 馬鈴薯連作障礙防控研究更多是通過田間試驗(yàn)來篩選或驗(yàn)證對連作障礙具有高抗性的種質(zhì)資源[33], 但對于以農(nóng)業(yè)訂單為導(dǎo)向的加工型馬鈴薯生產(chǎn)企業(yè)而言, 新品種的選用往往存在著極大的市場風(fēng)險(xiǎn)。并且通過基因工程手段來培育新的種質(zhì)資源或抗連作的馬鈴薯新品系也進(jìn)展緩慢。也有研究采用化學(xué)調(diào)控方法來進(jìn)行馬鈴薯連作障礙防控, 其主要機(jī)理是改善馬鈴薯植株對連作脅迫整體的生理抗性, 比如外源水楊酸和黃腐酸等[34- 35], 但這類方法對于生產(chǎn)實(shí)踐來講只是治標(biāo)不治本, 并且以上研究都是在模擬條件下進(jìn)行的, 未得到田間驗(yàn)證。本研究表明, 在大田條件下, 土壤滅菌和生物有機(jī)肥聯(lián)用能夠改善植株生長發(fā)育, 顯著增加塊莖產(chǎn)量, 提高植株生產(chǎn)力, 降低長期連作下馬鈴薯產(chǎn)量損失。從植株生理生態(tài)角度來看, 土壤滅菌和生物有機(jī)肥聯(lián)用處理有效緩解了馬鈴薯植株所受到的連作脅迫程度, 表現(xiàn)在ABR處理下植株根冠比以及葉片和根系的丙二醛含量較CK均有顯著下降。根冠比的調(diào)整是高等植物應(yīng)對外界生物或非生物脅迫的基本策略, 它能反映作物的生長發(fā)育狀況, 連作條件下土壤理化和生化環(huán)境的惡化導(dǎo)致馬鈴薯植株根冠比顯著增加[36-37]。丙二醛是活性氧自由基對細(xì)胞質(zhì)膜系統(tǒng)鏈?zhǔn)焦舻漠a(chǎn)物, 其含量下降對連作馬鈴薯葉片和根系細(xì)胞質(zhì)膜維持正常的結(jié)構(gòu)和功能具有重要的意義[36]。田間試驗(yàn)結(jié)果表明, ABR處理葉綠素含量和根系活力較CK均顯著增加, 連作馬鈴薯植株光合生理得到改善, 根系對水分和養(yǎng)分吸收增強(qiáng), 這是土壤滅菌和生物有機(jī)肥聯(lián)用后連作馬鈴薯塊莖產(chǎn)量大幅增加的生理基礎(chǔ)。而土壤環(huán)境改善是馬鈴薯植株連作障礙能夠得到緩解的必要條件。

3.2 土壤滅菌-生物有機(jī)肥聯(lián)用影響馬鈴薯連作土壤真菌群落結(jié)構(gòu)

大量的報(bào)道均已指出, 連作障礙問題的實(shí)質(zhì)是土壤障礙問題, 而調(diào)控連作土壤微生態(tài)環(huán)境是解決連作障礙問題的突破口。根據(jù)已有的文獻(xiàn)資料, 本研究首次報(bào)道馬鈴薯連作土壤微生態(tài)環(huán)境調(diào)控策略并加以田間驗(yàn)證, 即在抑制土傳病害致病菌的前提下通過攜帶有大量益生菌和拮抗菌的商品化生物有機(jī)肥應(yīng)用來逐步改善連作土壤微生物區(qū)系。農(nóng)作物長期連作種植通常導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變, 各種土傳病害滋生, 而其中真菌型土傳病害往往居多[8]。有鑒于此, 本研究將連作土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化作為研究重點(diǎn)。PCR-DGGE結(jié)果表明, 土壤滅菌和生物有機(jī)肥聯(lián)用能夠顯著影響馬鈴薯連作土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。在苗期、塊莖膨大期和淀粉積累期, ABR處理真菌群落多樣性指數(shù)較CK顯著下降約5%—20%, 并且多樣性指數(shù)與發(fā)病率之間存在著顯著或極顯著的正相關(guān)關(guān)系, 這種真菌群落結(jié)構(gòu)的變化是土壤滅菌和生物有機(jī)肥澆灌共同作用的結(jié)果[29,38-39]。沈宗專等[28]指出, 滅菌處理后土壤微生物活性下降, 不利于土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定, 易受其它微生物侵染。故在土壤滅菌后, 需及時(shí)補(bǔ)施生物有機(jī)肥, 增加土壤中有益微生物的數(shù)量及比例[27]。Wu等[39]對煙草青枯病的研究表明, 土壤滅菌和生物有機(jī)肥施用結(jié)合較單獨(dú)的土壤滅菌處理、土壤滅菌和堆肥結(jié)合相比能夠給土壤中補(bǔ)充大量的有益微生物, 如Bacillussp.,Paenibacillussp.,Trichodermasp.,Arthrobactersp.和Streptomycessp.等, 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)得到明顯改善, 而這是植株發(fā)病率下降的重要原因。傳統(tǒng)的肥料施用方法導(dǎo)致外源有益菌和拮抗菌遠(yuǎn)離根系, 不能形成在根區(qū)范圍的有效定植[40-42], 本研究通過將生物有機(jī)肥進(jìn)行多次兌水澆灌, 在生育期內(nèi)將有益菌和拮抗菌持續(xù)性地向馬鈴薯根際補(bǔ)充, 不僅能夠達(dá)到抑制病原菌的目的, 還能夠改善微生物群落結(jié)構(gòu), 有助于有益菌和拮抗菌在連作馬鈴薯根系周圍的“生物墻”形成[32], 這也是本研究與已有的相關(guān)報(bào)道在方法學(xué)上的最大不同。

3.3 土壤滅菌-生物有機(jī)肥聯(lián)用降低馬鈴薯連作土壤致病菌的數(shù)量

田間試驗(yàn)結(jié)果也表明, 土壤滅菌和生物有機(jī)肥聯(lián)用處理能夠顯著降低馬鈴薯連作土壤中土傳致病菌的數(shù)量。在兩個供試地塊上, ARB處理土壤中3種致病菌數(shù)量較CK在生育期內(nèi)均有大幅下降, 致病菌數(shù)量與植株發(fā)病率和病薯率之間均有著顯著或極顯著的正相關(guān)關(guān)系。土傳致病菌數(shù)量的下降減少了植株和薯塊被侵染的風(fēng)險(xiǎn), 這是發(fā)病率和病薯率顯著降低的直接原因。氨水已被證明是一種良好的化學(xué)滅菌劑, 能夠殺滅土壤中多種病原微生物, 其機(jī)理是氨能夠抑制真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長[28,38]。氨水滅菌后土壤真菌數(shù)量會出現(xiàn)顯著下降, 而細(xì)菌數(shù)量并不會發(fā)生明顯的變化, 氨水滅菌對細(xì)菌的影響要小于真菌[28], 這對于以真菌型土傳病害為主的甘肅省中部沿黃灌區(qū)馬鈴薯連作系統(tǒng)而言尤為重要, 能夠有效避免對土壤微生物區(qū)系的過度擾動。此外, 在本研究的土壤滅菌處理過程中, 半腐熟玉米秸稈的添加結(jié)合飽和灌水實(shí)際上也誘導(dǎo)了上層土壤強(qiáng)還原環(huán)境的形成, 這對于播前土壤中真菌型病原菌的抑制同樣具有積極作用[43]。但播前滅菌并不能完全殺滅土壤中所有的致病微生物, 因而在生育期內(nèi)通過土壤調(diào)控形成對病原菌的持續(xù)抑制十分重要, 將病原菌的數(shù)量控制在不發(fā)病或輕度發(fā)病的閾值內(nèi)。在本試驗(yàn)中也可以看出, ABR處理和CK間土壤病原菌數(shù)量差異出現(xiàn)播前小于塊莖膨大和淀粉積累期的現(xiàn)象, 表明在播前滅菌的基礎(chǔ)上通過生物有機(jī)肥的澆灌能夠形成對病原菌的持續(xù)抑制。連作馬鈴薯生長過程中, 除了生物有機(jī)肥攜帶的拮抗菌直接作用于病原菌外, 土壤微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)的改變也是真菌型土傳病原菌能夠被持續(xù)抑制, 植株發(fā)病率和病薯率下降的重要原因, 這在其它研究中已被充分驗(yàn)證[27,31- 32,44], 但其機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。早前關(guān)于蘋果連作障礙的研究表明, 使用溴甲烷作為化學(xué)滅菌劑并結(jié)合堆肥改良并不能改善果樹生長發(fā)育狀況和提高果實(shí)產(chǎn)量, 推測可能與供試作物差異以及連作障礙程度有關(guān)[45]。此外, 堆肥中缺乏有益微生物或拮抗微生物, 土壤滅菌結(jié)束后, 單靠有機(jī)碳輸入來提高土壤生物活性難以達(dá)到持續(xù)抑制致病菌的目的[19]。

綜上所述, 在甘肅中部沿黃灌區(qū), 土壤滅菌和生物有機(jī)肥聯(lián)用能夠有效改善長期連作條件下馬鈴薯植株的生長發(fā)育和生理特征, 顯著抑制土傳病害滋生, 提高塊莖產(chǎn)量, 降低集約化生產(chǎn)條件下馬鈴薯產(chǎn)量損失。其主要機(jī)理在于土壤滅菌和生物有機(jī)肥聯(lián)用有效降低了連作土壤中病原菌數(shù)量和改善了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。但在馬鈴薯長期連作條件下, 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對土壤滅菌和生物有機(jī)肥聯(lián)用的響應(yīng)本研究并未涉獵。因而在下一步研究工作中, 彌補(bǔ)這一短板并結(jié)合高通量測序等分子生物學(xué)技術(shù)能夠加深我們對“疾病”土壤微生物區(qū)系向“健康”土壤微生物區(qū)系的變化路徑或演進(jìn)特征等方面的了解。

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Combination of the application of soil disinfection and bio-organic fertilizer amendment and its effects on yield and quality of tubers, physiological characteristics of plants, and the soil fungal community in a potato monoculture system

LIU Xing1, ZHANG Wenming1, ZHANG Chunhong1, QIU Huizhen1,*, LI Ruiqin2, WANG Di3, SHEN Qirong4

1CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences/GansuProvincialKeyLabofAridlandCropScience,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China2AnimalHusbandryandPastureandGreenAgricultureInstitutes,GansuAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730070,China3CollegeofAgronomy,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China4CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China

The irrigated areas along the Yellow River in central Gansu Province form one of the main potato growing regions in China. However, continuous monoculture practices, which are required for intensive production in order to maximize profits, have already impaired the development of the potato industry in the region. This is reflected in severe production losses in terms of tuber yield and quality, in the poor growth and development of potato plants, and in rapidly increasing problems related to fungal soil-borne diseases. In this study, we combined the application of soil disinfection and bio-organic fertilizer amendment to recover potato plant productivity in a continuously monoculture system. Additionally, efforts were made to improve the micro-environment of the potato rhizosphere by inhibiting soil-borne pathogens via soil disinfection prior to sowing the potatoes and then directly irrigating plants with bio-organic fertilizer mixed with water injected into potato rhizosphere after potato emergence. The commercial bio-organic fertilizer used contained a large amount of plant growth-promoting rhizobacteria as well as antagonistic microorganisms active against known soil-borne fungal pathogens. Irrigation with bio-organic fertilizer was performed three times at 20 day intervals during the entire growing period of the potato plants. Field experiments were conducted in two plots that had previously displayed severe continuous monoculture-related problems, one of which had been continuously planted with potato crops for over five years and the other for over six years. The goal was to evaluate the effects of a combined application of soil disinfection and bio-organic fertilizer amendment (ABR treatment) on the management of problems related to continuous potato monoculture. The field experiment included a control (CK) and an ABR treatment with three replicates of both. Specifically, the study examined tuber yield and quality, physiological characteristics of potato plants, and the structure of the soil fungal community in a long-duration monoculture system with and without soil treatment. Compared with CK, the ABR treatment significantly increased tuber yield and the ratio of marketable tubers by 71.1% to 152.1% and 39.2% to 53.3%, respectively. No distinct differences were observed between the chemical qualities of potato tubers produced by ABR or CK treatments. In terms of the physiological characteristics of potato plants, the ABR treatment significantly increased the chlorophyll content of leaves and the root vigor as compared to CK, but decreased the MDA content both in leaves and in roots, indicating that the ABR treatment could improve growth and development of potato plants in a continuous monoculture system. Based on Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (PCR-DGGE), the ABR treatment significantly affected the structure of soil fungal community, since fungal diversity index was significantly lower in ABR than in CK. Additionally, the ABR treatment effectively suppressed soil-borne diseases, with plants exhibiting a lower incidence of disease and a lower ratio of diseased tubers from 67.2% to 82.2% and 69.1% to 70.5%, respectively, when compared with CK. Real-time PCR assessment confirmed that the abundance of several pathogenic soil fungi (Rhizoctoniasolani,Fusarinmsolani, andFusariumsambucinum) in the ABR treatment was significantly lower than that in CK during the potato growth stage. In the present study, the highly significant linear correlation were revealed between tuber yield and plant disease incidence, fungal diversity index, and the abundance of soil-borne pathogens, respectively. The combined application of soil disinfection and bio-organic fertilizer amendment is a potential approach to managing problems related to continuous potato monoculture in the irrigated areas of the Yellow River floodplain in central Gansu Province since it suppresses soil-borne diseases and improves the structure of the soil microbial community.

potato; monoculture; bio-organic fertilizer; soil disinfection; soil-borne disease

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201103004)；國家科技支撐計(jì)劃(2012BAD06B03)；國家馬鈴薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS- 10-P18)；甘肅省科技重大專項(xiàng)(1102NKDA025)

2015- 04- 11;

日期:2016- 01- 22

10.5846/stxb201504110737

*通訊作者Corresponding author.E-mail: hzqiu@gsau.edu.cn

劉星, 張文明, 張春紅, 邱慧珍, 李瑞琴, 王蒂, 沈其榮.土壤滅菌-生物有機(jī)肥聯(lián)用對連作馬鈴薯及土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2016,36(20):6365- 6378.

Liu X, Zhang W M, Zhang C H, Qiu H Z, Li R Q, Wang D, Shen Q R.Combination of the application of soil disinfection and bio-organic fertilizer amendment and its effects on yield and quality of tubers, physiological characteristics of plants, and the soil fungal community in a potato monoculture system.Acta Ecologica Sinica,2016,36(20):6365- 6378.