尹 雯

(河北省滄州市中心醫(yī)院，河北 滄州 061001)

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紫草素對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制研究

尹 雯

(河北省滄州市中心醫(yī)院，河北 滄州 061001)

目的 研究紫草素(Shikonin)對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞，設(shè)空白對(duì)照組、紫草素0.3 μg/mL組、紫草素0.5 μg/mL組、紫草素0.7 μg/mL組和順鉑40 μg/mL組，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔。各組給予相應(yīng)干預(yù)48 h后，采用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率，F(xiàn)low Cytometry法檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡狀況并計(jì)算細(xì)胞凋亡率，RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中bcl-2 mRNA、bax mRNA表達(dá)情況并計(jì)算bax/bcl-2比值，Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)情況并進(jìn)行半定量分析。結(jié)果 與空白對(duì)照組相比，紫草素0.5 μg/mL組、紫草素0.7 μg/mL組和順鉑40 μg/mL組Ishikawa細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率、G0/G1期細(xì)胞比例、bax mRNA表達(dá)量及bax/bcl-2比值、Caspase-3蛋白表達(dá)量均顯著升高(P均<0.05)，而G2/M期細(xì)胞比例及bcl-2 mRNA表達(dá)量均顯著降低(P均<0.05)；且紫草素0.7 μg/mL組Ishikawa細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率、bax/bcl-2比值和Caspase-3蛋白表達(dá)量均明顯高于順鉑40 μg/mL組(P均<0.05)，bcl-2 mRNA表達(dá)量明顯低于順鉑40 μg/mL組(P均<0.05)。結(jié)論 紫草素具有抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的作用，機(jī)制可能與紫草素調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)有關(guān)。

紫草素；子宮內(nèi)膜癌；Ishikawa細(xì)胞；增殖；凋亡

子宮內(nèi)膜癌占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的30%左右，居第一位；占女性惡性腫瘤的7%左右，僅次于乳腺癌、肺癌和大腸癌[1]。目前，臨床上主要采取手術(shù)切除和術(shù)后化療的方案治療，能夠相對(duì)延長子宮內(nèi)膜癌患者生命，但其高復(fù)發(fā)率仍嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。紫草又名紫丹、地血，為紫草科植物硬紫草的根，是我國傳統(tǒng)中藥品種之一，《本草綱目》和《唐本草》等醫(yī)學(xué)典籍中均有記載，可涼血、活血、解毒透疹；紫草素是中藥紫草的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等廣泛的生物學(xué)活性[2-5]。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞并給予紫草素進(jìn)行干預(yù)，以順鉑干預(yù)為陽性對(duì)照，研究紫草素對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 細(xì)胞、藥物與試劑 子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞(上海拜力生物科技有限公司)；紫草素(中國藥品生物制品檢定所，純度≥98%)；注射用順鉑(山東齊魯制藥有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；MTT(美國Sigma公司)；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(德國Bendermed公司)；bcl-2、bax上下游引物(上海博亞生物公司)；Caspase-3單體(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將Ishikawa細(xì)胞株經(jīng)解凍復(fù)蘇后植入DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)并取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰酶消化后將細(xì)胞濃度調(diào)整至5×104mL-1，培養(yǎng)24 h后分為空白對(duì)照組、紫草素0.3 μg/mL組、紫草素0.5 μg/mL組、紫草素0.7 μg/mL組和順鉑40 μg/mL組，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔，各組給予相應(yīng)干預(yù)48 h后行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2 增殖抑制率的測(cè)定 取各組細(xì)胞調(diào)整濃度至5×104mL-1后接種于96孔板(n=10)，分別滴加20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，培養(yǎng)4 h后去上清，分別加入DMSO 200 μL，振蕩10 min后通過酶標(biāo)儀測(cè)定波長570 nm處吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100%[6]。

1.2.3 細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 干預(yù)48 h后，通過離心(10 000 r/min，5 min)取細(xì)胞，PBS洗滌后加70%乙醇5 mL混勻，置4 ℃環(huán)境48 h，離心取細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后采用1 mL PBS打散細(xì)胞團(tuán)后加5 μL水解酶Rnase(10 mg/mL)，置37 ℃環(huán)境1 h，加入碘化丙啶染液，避光孵育30 min，然后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，采用CELL Quest軟件分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期時(shí)相及凋亡狀況。

1.2.4 細(xì)胞中bcl-2 mRNA、bax mRNA表達(dá)檢測(cè)及bax/bcl-2比值計(jì)算 通過基因文庫查詢并設(shè)計(jì)合成bcl-2、bax、β-actin基因上、下游引物。bcl-2引物：上游為5’-GGGATGC CTTTGTGGAACTA-3’，下游為5’-TGATTTGA CCATTTGCCTGA-3’；bax引物：上游為5’-ATCCAGGATCGAGCAGGGAGGATGG-3’，下游為5’-AGATGGTCACTGTCT GCCATGTGGG-3’；β-actin引物：上游為5’-CCTG TATGCCTCTGGTCGTA-3’，下游為5’-CCATCTCTTG CTCGAAGTCT-3’。干預(yù)48 h后，經(jīng)0.25%胰酶消化并收集各組細(xì)胞，加入適量TRIzol試劑提取總RNA并測(cè)定總RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增完畢后取PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳，最后通過凝膠成像儀觀察并照相。以β-actin為內(nèi)參，半定量分析bcl-2 mRNA、bax mRNA表達(dá)情況，計(jì)算bax/bcl-2比值。

1.2.5 Caspase-3蛋白表達(dá)的檢測(cè) 離心取各組細(xì)胞，經(jīng)PBS溶液洗滌3次后超聲碎裂細(xì)胞，12 000 r/min低溫(4 ℃)離心20 min取沉淀，通過BCA法進(jìn)行蛋白定量，蛋白變性后上樣、電泳，待溴酚藍(lán)接近膠底部時(shí)停止、轉(zhuǎn)膜、春紅溶液染色，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗( Caspase-3，β-actin)4 ℃過夜；洗膜，二抗室溫?fù)u床上孵育1 h后經(jīng)ECL顯色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用Quantity One軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率 空白對(duì)照組細(xì)胞增殖抑制率為(0.0±0.0)%，紫草素0.3 μg/mL組為(23.9±5.7)%，紫草素0.5 μg/mL組為(45.1±7.2)%，紫草素0.7 μg/mL組為(67.3±8.4)%，順鉑40 μg/mL組為(42.6±5.8)%；紫草素各劑量組和順鉑40 μg/mL組細(xì)胞增殖抑制率均明顯高于空白對(duì)照組(P均<0.05)，且紫草素0.7 μg/mL組細(xì)胞增殖抑制率明顯高于順鉑組(P<0.05)。

2.2 各組細(xì)胞周期 與空白對(duì)照組比較，紫草素0.5 μg/mL劑量組、紫草素0.7 μg/mL劑量組和順鉑40 μg/mL組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增高(P均<0.05)，G2/M期細(xì)胞比例顯著降低(P均<0.05)，而紫草素0.5 μg/mL劑量組、紫草素0.7 μg/mL劑量組和順鉑40 μg/mL組G0/G1期、G2/M期細(xì)胞比例比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞周期比較±s，%)

注：①與空白對(duì)照組比較,P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞凋亡狀況 與空白對(duì)照組比較，紫草素各劑量組和順鉑40 μg/mL組細(xì)胞凋亡狀況呈不同程度加重，見圖1；正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(2.7±1.5)%，紫草素0.3 μg/mL組為(21.5±5.3)%，紫草素0.5 μg/mL組為(43.8±6.9)%，紫草素0.7 μg/mL組為(70.4±8.7)%，順鉑40 μg/mL組為(35.3±6.2)%，紫草素各劑量組和順鉑40 μg/mL組細(xì)胞凋亡率均明顯高于空白對(duì)照組(P均<0.05)，且紫草素0.7 μg/mL組明顯高于順鉑40 μg/mL組(P<0.05)。

2.4 各組細(xì)胞bcl-2 mRNA、bax mRNA表達(dá)量和bax/bcl-2比值 與空白對(duì)照組比較，紫草素0.5 μg/mL劑量組、紫草素0.7 μg/mL劑量組和順鉑40 μg/mL組bcl-2 mRNA表達(dá)量顯著降低(P均<0.05)，bax mRNA表達(dá)量及bax/bcl-2比值均顯著升高(P均<0.05)；且紫草素0.7 μg/mL組bcl-2 mRNA表達(dá)量明顯低于順鉑40 μg/mL組(P<0.05)，bax/bcl-2比值顯著高于順鉑40 μg/mL組(P<0.05)。見圖2和表2。

2.5 各組細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)情況 空白對(duì)照組Caspase-3蛋白表達(dá)量為0.08±0.03，紫草素0.3μg/mL組為0.25±0.09，紫草素0.5 μg/mL組為0.31±0.12，紫草素0.7μg/mL組為0.43±0.17，順鉑40μg/mL組為0.16±0.05。紫草素各劑量組和順鉑40 μg/mL組Caspase-3蛋白表達(dá)量均顯著高于空白對(duì)照組(P均<0.05)，且紫草素0.7 μg/mL組Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著高于順鉑40 μg/mL組(P<0.05)。見圖3。

A為空白對(duì)照組；B為紫草素0.3 μg/mL組；C為紫草素0.5 μg/mL組；D為紫草素0.7 μg/mL組；E為順鉑40 μg/mL組

自左至右依次為空白對(duì)照組、紫草素0.3 μg/mL組、紫草素0.5 μg/mL組、紫草素0.7 μg/mL組、順鉑40 μg/mL組

組別孔數(shù)bcl-2mRNA/10-3baxmRNA/10-3bax/bcl-2空白對(duì)照組1042.5±13.862.7±24.91.5±0.8紫草素0.3μg/mL組1034.0±10.671.0±32.42.1±1.1紫草素0.5μg/mL組1022.8±7.9①89.5±36.1①3.9±1.5①紫草素0.7μg/mL組1013.1±5.0①②117.4±40.3①9.0±3.4①②順鉑40μg/mL組1023.7±8.2①95.6±34.9①4.1±1.9①

注：①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與順鉑40 μg/mL組比較，P<0.05。

A為空白對(duì)照組；B為紫草素0.3 μg/mL組；C為紫草素0.5 μg/mL組；D為紫草素0.7 μg/mL組；E為順鉑40 μg/mL組

3 討 論

紫草素是一種具有廣泛生物學(xué)活性的萘醌類化合物。于海榮等[7]研究發(fā)現(xiàn)紫草素能夠通過改變膜電位以及促進(jìn)內(nèi)源性活性氧的生成而抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖；魯昊等[8]通過體外培養(yǎng)人喉癌Hep-2細(xì)胞并給予紫草素進(jìn)行干預(yù)研究發(fā)現(xiàn)，紫草素能夠通過改變細(xì)胞周期而起到抑制Hep-2細(xì)胞增殖的作用；陳菊英等[2]研究發(fā)現(xiàn)紫草素具有促進(jìn)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬的作用；陳志爐等[3]研究發(fā)現(xiàn)紫草素具有抑制白血病細(xì)胞HL-60增殖并促進(jìn)其凋亡的作用。筆者以人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞為受試細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，紫草素干預(yù)能夠顯著提高Ishikawa細(xì)胞增殖抑制率，能夠?qū)shikawa細(xì)胞阻滯于G0/G1期并提高細(xì)胞凋亡率，并且紫草素0.7 μg/mL組細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率均顯著高于順鉑40 μg/mL組，提示紫草素具有抑制人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的作用。

細(xì)胞凋亡是一種由多種基因參與調(diào)控的程序化死亡過程，包括bcl-2基因家族，其中bcl-2為凋亡抑制基因，bax為促凋亡基因，二者相互作用，共同調(diào)控細(xì)胞凋亡[9]。Jayanthi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，bcl-2和bax對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控不僅與二者的表達(dá)密切相關(guān)，甚至更依賴于bax/bcl-2比值，bax/bcl-2比值越高，促凋亡作用越強(qiáng)。此外，Caspases基因家族也是細(xì)胞凋亡過程中非常重要的調(diào)控基因，其中Caspase-3是激活各種凋亡刺激因子的關(guān)鍵蛋白酶，參與凋亡的啟動(dòng)以及整個(gè)凋亡過程的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫草素干預(yù)能夠顯著下調(diào)Ishikawa細(xì)胞bcl-2基因表達(dá)并上調(diào)bax基因表達(dá)，提高bax/bcl-2比值，上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)，此可能是紫草素抑制人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的重要分子機(jī)制之一。

綜上所述，紫草素具有抑制人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的作用，機(jī)制可能與紫草素能夠有效調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)有關(guān)。

[1] 余思云,黃彩梅,胡國華.紫草素通過PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌 Ishik awa細(xì)胞凋亡[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2014,9(12):1303-1306

[2] 陳菊英,劉朝純,曾智,等.紫草素通過PI3K/Akt通路促進(jìn)人乳腺癌 MCF-7細(xì)胞自噬[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2013,29(2):194-198

[3] 陳志爐,戴其舟,王勇,等.紫草素對(duì)白血病細(xì)胞HL-60增殖及凋亡作用的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012,32(2):239-243

[4] 代巧妹,李冀,顏培宇.紫草素免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息,2012,29(6):116-118

[5] 趙雪梅,王桂玲,費(fèi)洪榮,等.紫草有效成分的提取及其抗炎作用研究[J].中藥藥理與臨床,2008,24(4):36-38

[6] 楊京哲,張凌霄,邢永靜,等.紫草素對(duì)子宮內(nèi)膜癌 Ishikawa 細(xì)胞生長的作用研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013,22(23):2520-2523

[7] 于海榮,苗浩,龐沖,等.紫草素對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制研究[J].中國生化藥物雜志,2015,35(4):16-18

[8] 魯昊,康健.紫草素對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞生長的作用研究[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2011,30(2):350-354

[9] 張彥清,劉保江,田首元.丙泊酚對(duì)大鼠離體缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡和Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2011,9(1):55-57

[10] Jayanthi S,Deng X,Bordelon M,et al.Methamphetamine causes differential regulation of pro-death and anti-death Bcl-2 genes in the mouse neocortex[J].FASEB J,2001，15(10):1745-1752

Effects and mechanism of Shikonin on the proliferation and apoptosis of endometrial Ishikawa cancer cell

YIN Wen

(Cangzhou Central Hospital,Cangzhou 061001,Hebei,China)

Objective It is to investigate the effects and mechanism of Shikonin on the proliferation and apoptosis of endometrial Ishikawa cancer cell.Methods The endometrial Ishikawa cancer cells were cultured and divided into five groups:blank control group,Shikonin (0.3,0.5,0.7 μg/mL) groups and Cisplatin 40 μg/mL group.In 48 hours after the drugs were given,the cellular growth inhibition rate was calculated by MTT,cell cycle and apoptosis rate were analyzed by flow cytometry,the expression of bax mRNA and bcl-2 mRNA were detected by RT-PCR,and the ratio of bax/bcl-2 was calculated,the expression of caspase-3 protein was detected by Western blotting.Results Compared with blank control group,the cellular growth inhibition rate of Shikonin (0.5,0.7 μg/mL) groups were significantly increased;the cell cycle was arrested at G0/G1phase,the apoptosis rate was significantly increased;the expression of bcl-2 mRNA was significantly decreased,while the expression of bax mRNA was significantly increased,and the ratio of bax/bcl-2 were significantly increased;the expression of caspase-3 protein were significantly increased;all of the difference above were significant(P<0.05).Conclusion Shikonin had inhibitive effects on the proliferation and accelerating effects on the apoptosis of endometrial Ishikawa cancer cell;which perhaps was related to its effects of altering the expression of apoptosis-related genes and proteins.

Shikonin;endometrial cancer;Ishikawa cell;proliferation;apoptosis

尹雯，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事婦科疾病研究工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.32.005

R-33

A

1008-8849(2016)32-3548-04

2016-04-10