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        UPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定刺五加葉中Chlorogenic acid,Rutin,Hyperoside及Isoquercitrin四種成分的含量

        2016-11-29 02:16:11翟春梅史連宏陳忠新王知斌孟永海
        中醫(yī)藥信息 2016年5期
        關(guān)鍵詞:槲皮苷桃苷刺五加

        翟春梅,史連宏,陳忠新,王知斌,孟永海*

        (1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150040)

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        質(zhì) 量 工 藝

        UPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定刺五加葉中Chlorogenic acid,Rutin,Hyperoside及Isoquercitrin四種成分的含量

        翟春梅1,2,史連宏1,2,陳忠新1,2,王知斌1,2,孟永海1,2*

        (1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150040)

        目的:建立UPLC同時(shí)定量刺五加葉藥材中Chlorogenic acid,Rutin,Hyperoside及Isoquercitrin等4種有效成分的方法。方法:色譜柱:HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm,Waters);柱溫:40℃;流速:0.4 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;流動(dòng)相A:0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B:乙腈;梯度洗脫,洗脫條件:0~8 min,88%~75% A;8~9 min,75%~88% A;9~10 min,88%~88%A;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm。結(jié)果:對(duì)9批產(chǎn)地的刺五加葉藥材進(jìn)行測(cè)定,綠原酸最高的是虎林(1.287 mg/g);蘆丁含量最高的是雞東(0.122 mg/g);金絲桃苷含量最高的是賓縣(0.528 mg/g);異槲皮苷含量最高的是五常(0.337 mg/g)。結(jié)論:該方法可用于刺五加葉中四種成分的含量測(cè)定,本研究所建立的方法穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性良好,適用于刺五加葉的含量測(cè)定;不同來(lái)源的藥材成分含量差異顯著,對(duì)刺五加實(shí)施多指標(biāo)的含量控制是保證其臨床藥用安全可控的必要途徑。

        刺五加葉;UPLC-DAD;綠原酸;蘆?。唤鸾z桃苷;異檞皮苷

        中藥“刺五加” (根莖)自古即被視為具有添精補(bǔ)髓及抗衰老作用的良藥,主要用于治療風(fēng)濕痹痛,腰膝酸痛等證?,F(xiàn)代研究其具有抗疲勞、抗癌、抗心律失常、降血糖等作用。然而,由于刺五加食用藥用價(jià)值均高,長(zhǎng)期以來(lái)一直被掠奪式的采挖,致使野生資源遭到了嚴(yán)重破壞,1992年中國(guó)植物紅皮書已將刺五加列入漸危物種。然而如何使刺五加物盡其用,又能保護(hù)其資源呢?刺五加葉資源豐富、可再生,大部分刺五加葉自生自滅,至今無(wú)人利用。我國(guó)學(xué)者對(duì)刺五加葉進(jìn)行了治療糖尿病藥理學(xué)研究[1-7],發(fā)現(xiàn)其具有良好的治療糖尿病活性。葉中主要含有皂苷類、黃酮類和酚酸類等成分,與其根莖中的成分大部分類似[8],黃酮及酚酸類成分中的蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、綠原酸等成分含量較高。本研究釆用超高效液相色譜法并結(jié)合超高效液相色譜柱,在10 min內(nèi)同時(shí)測(cè)定了刺五加葉中這四種主要成分的含量,并進(jìn)行了全面的方法學(xué)考察。本研究建立了一種快速、有效地控制刺五加葉的質(zhì)量的方法。

        1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

        ACQUITYTMUPLC超高效液相色譜系統(tǒng),Xevo QTof MS質(zhì)譜系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司),采用電噴霧離子源(ESI)、二元高壓泵、在線脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱。數(shù)據(jù)采集與處理采用Masslynx 4.1軟件。數(shù)控超聲波清洗器(型號(hào):KQ-500DB,昆山市超聲儀器有限公司);電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);Milli‐Q 純水器(密理博上海貿(mào)易有限公司)。

        乙腈、甲醇(色譜純,美國(guó)Fisher公司);甲酸(色譜純,美國(guó)TEDIA公司);對(duì)照品金絲桃苷(批號(hào)111521-200303,含量≥98%,HPLC) 購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定中心。對(duì)照品綠原酸(批號(hào)110753),蘆丁(批號(hào)MUST-14102301), 異槲皮苷(批號(hào)MUST-14070211)均購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司。

        刺五加葉藥材購(gòu)自黑龍江省綏芬河地區(qū),經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室王振月教授鑒定為五加科植物刺五加(Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.)Harm)的干燥葉。

        圖1 綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

        2 方法與結(jié)果

        2.1 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液的制備

        精密稱取對(duì)照品(經(jīng)減壓干燥至恒重)綠原酸5.06 mg,蘆丁4.12 mg,金絲桃苷6.19 mg,異槲皮苷5.08 mg,置10 mL容量瓶中,用甲醇分別配置成濃度為506 μg/mL,412 μg/mL,619 μg/mL,508 μg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。再將儲(chǔ)備液制成6個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,構(gòu)建成標(biāo)準(zhǔn)曲線。將刺五加葉藥材干燥并粉碎,過(guò)0.9 mm篩后用石油醚浸泡后超聲30 min,棄去浸提液,再加石油醚超聲,反復(fù)多次至浸提無(wú)色,使葉綠素完全除去后傾去浸提液,將藥材殘?jiān)糜谕L(fēng)處干燥。精密稱取2 g藥材粉末置具塞錐形瓶中并向其中加入50 mL甲醇,密塞并稱定其重量,浸泡2 h后,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)60 min,放冷后,稱定其重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻并濾過(guò),濾液為供試品溶液。

        2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性

        色譜柱:HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm,Waters);柱溫:40℃;流速:0.4 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;流動(dòng)相A:0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B:乙腈;梯度洗脫,洗脫條件:0~8 min,88%~75% A;8~9 min,75%~88% A;9~10 min,88%~88%A;檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm。甲醇按上述色譜法測(cè)定,結(jié)果表明溶劑對(duì)綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷的測(cè)定無(wú)干擾。見圖2。

        圖2 樣品(A)、對(duì)照品(B)空白對(duì)照色譜圖(C)注:1.綠原酸(Chlorogenic acid);2.蘆丁(Rutin);3.金絲桃苷(Hyperoside);4.異槲皮苷(Isoquercitrin)。

        2.3 線性關(guān)系考察

        精密吸取上述2.1制備的儲(chǔ)備液配制成不同濃度的對(duì)照品溶液,按照2.2色譜條件項(xiàng)下進(jìn)行測(cè)定,進(jìn)樣體積為5 μL。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X),以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果線性關(guān)系良好,見表1。

        表1 Chlorogenic acid,Rutin,Hyperoside及Isoquercitrin標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

        2.4 精密度試驗(yàn)

        日內(nèi)精密度:分別精密吸取三個(gè)不同濃度的含有綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷的混合對(duì)照品溶液5 μL,重復(fù)進(jìn)樣3次測(cè)定峰面積,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度,計(jì)算濃度的RSD值。

        日間精密度:分別精密吸取三個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液5 μL,連續(xù)進(jìn)樣3天測(cè)定峰面積,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度,計(jì)算濃度的RSD值。結(jié)果綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷濃度的 RSD均小于5%,表明精密度良好。

        2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

        精密稱取同一批刺五加葉藥材9份,按供試品溶液的制備方法制得供試品溶液,包括高、中、低三個(gè)不同的濃度并且每個(gè)濃度一式三份,進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算含量。結(jié)果顯示綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷濃度的RSD均小于5%,說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

        2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        精密吸取同一供試品溶液5 μL,分別于0、2、4、6、8、12和24 h進(jìn)樣,記錄色譜峰面積,分別按樣品含量測(cè)定法測(cè)定。結(jié)果顯示綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷峰面積的RSD均小于5%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.7 加樣回收率試驗(yàn)

        精密稱取已知含量的樣品,分別加入綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷對(duì)照品溶液,按供試品溶液的制備方法制得供試品溶液,包括高、中、低三個(gè)不同的濃度并且每個(gè)濃度一式三份,測(cè)定并計(jì)算各成分的加樣回收率以及RSD。(測(cè)得值-樣品中含量)/加入量×100%。結(jié)果顯示綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷的加樣回收率RSD均小于5%,表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

        2.8 樣品含量測(cè)定

        結(jié)果表明該方法可用于刺五加葉中四種成分的含量測(cè)定,并對(duì)9批產(chǎn)地的刺五加葉藥材進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果(見表2)發(fā)現(xiàn)9批產(chǎn)地中,綠原酸最高的是虎林(1.287 mg/g);蘆丁含量最高的是雞東(0.122 mg/g);金絲桃苷含量最高的是賓縣(0.528 mg/g);異槲皮苷含量最高的是五常(0.337 mg/g);綜合考慮,質(zhì)量最優(yōu)的產(chǎn)地是五常,是為進(jìn)一步的藥理研究及中藥藥效物質(zhì)研究提供依據(jù)。

        表2 9批產(chǎn)地的刺五加葉中四種成分的含量測(cè)定

        3 討論與小結(jié)

        3.1 供試品溶液的制備方法的選擇

        用超聲提取法提取,考察了提取溶劑甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇、60%乙醇,結(jié)果以50%乙醇提取率最高,故提取溶劑選擇50%乙醇。對(duì)提取時(shí)間(30 min,60 min,90 min),提取次數(shù)(1次,2次)因素進(jìn)行考察,用50%乙醇50 mL提取時(shí)間90 min,提取2次的提取率最高。

        3.2 色譜條件的選擇

        考察了甲醇-水,乙腈-水系統(tǒng)在不同的梯度下并向其中加入不同比率的甲酸,乙酸及甲酸銨。發(fā)現(xiàn)乙腈-水系統(tǒng)并分別向其中加入0.1%甲酸為最優(yōu)條件。此條件下峰形較好,分析時(shí)間短,高分離度,柱壓低。選擇合適的梯度是分離的關(guān)鍵,因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中金絲桃苷和異槲皮苷是同分異構(gòu)體,極性非常相似,比較難分離。曾有文獻(xiàn)研究通過(guò)高效液相色譜法分離這兩種化合物,但分離的時(shí)間較長(zhǎng),條件繁瑣。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜,簡(jiǎn)單、快速地將其基線分離并準(zhǔn)確測(cè)量出其含量。

        3.3 小結(jié)

        本章建立了一種靈敏度高、穩(wěn)定性好、簡(jiǎn)單快速的UPLC-DAD的含量檢測(cè)方法。主要是對(duì)刺五加葉中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷的含量測(cè)定方法,并對(duì)該方法進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)考察,結(jié)果表明該方法可用于刺五加葉中四種成分的含量測(cè)定,為進(jìn)一步闡明開發(fā)刺五加葉提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        [1] 睢大筼,呂忠智,李淑慧,等.刺五加葉皂甙降血糖作用[J].中國(guó)中藥雜志,1994,19(11):683-6851.

        [2] 睢大筼,呂忠智,于曉鳳.刺五加葉皂甙的抗應(yīng)激作用研究[J].人參研究,1996,8(11):34-36.

        [3] 倪勁松,吳家祥,肖紉秋,等.刺五加皂甙對(duì)糖尿病大鼠血過(guò)氧化脂質(zhì)和超氧化物歧化酶的影響[J].白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1998,24(1):33-34.

        [4] 王杰,田剛,劉立刺,等.五加葉皂甙對(duì)免疫功能的影響[J].人參研究,1997,9(3):35-36.

        [5] 王柏欣,王淑湘,譚宏,等.刺五加葉皂甙對(duì)糖尿病大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化物的作用[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2004,27(2):1-2.

        [6] 扈清云,李艷君,王景濤,等.刺五加葉皂甙對(duì)II型糖尿病大鼠胰島素分泌影響的形態(tài)學(xué)研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2003,26(6):21-22.

        [7] 趙曉蓮,關(guān)政.刺五加葉皂甙對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2003,26(6):59.

        [8] Huang LZ,Zhao HF,Huang BK,et al.Acanthopanax senticosus: review of botany, chemistry and pharmacology[J].Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences,2011,66(2):83-97.

        UPLC-DAD Method for Quantification on Chlorogenic Acid, Rutin,Hyperoside and Isoquercitrin in Extract of E.Senticosus Leaf

        ZHAI Chun-mei1,2,SHI Lian-hong1,2,CHEN Zhong-xin1,2,WANG Zhi-bin1,2,MENG Yong-hai1,2*

        (1.KeyLaboratoryofChineseMateriaMedica(MinistryofEducation)HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.KeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineandNaturalMedicinePharmacodynamicMaterialBasesResearchinHeilongjiangProvince,Harbin150040,China)

        Objective:To establish the UPLC-DAD method for quantification on Chlorogenic acid, Rutin, Hyperoside and Isoquercitrin in extract of E. senticosus leaf. Methods:Column: HSS T3 (100 mm×2.1 mm,1.8 μm, Waters); Column temperature: 40℃; Flow rate: 0.4 mL/min; Injection volume: 5 μL; Mobile phase A: 0.1% aqueous formic acid, Mobile phase B: acetonitrile; Gradient elution conditions: 0-8 min: 88%-75%A,8-9 min: 75%-88%A,9-10 min: 88%-88%A. Detection wavelength: 360 nm. Results:Totally 55 compounds including triterpenoid saponins, flavonoid glycosides, organic acids and other compounds were identified by Scifinder database and reference literatures in the optimized LC-MS conditions. Conclusion:It is a fast, accurate and comprehensive method to identify the chemical ingredients of E. senticosus leaf by UPLC/Q-TOF-MS/MS.

        E.senticosus leaf; UPLC-DAD;Chlorogenic acid;Rutin;Hyperoside;Isoquercitrin

        黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目(No.QC2012C064);黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀青年教師支持計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012RCQ16)

        翟春梅(1978-),女,中藥學(xué)博士,高級(jí)實(shí)驗(yàn)師,主要研究方向:中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

        孟永海*(1978-),男,副教授,碩士研究生導(dǎo)師,主要研究方向:中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

        2016-04-11

        R28

        A

        1002-2406(2016)05-0052-03

        修回日期:2016-05-04

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