魏新智，樊暉，王清華，閔冬雨，王英，王琿

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110847)

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安神方鎮(zhèn)靜催眠作用及其機(jī)制初探

魏新智，樊暉，王清華，閔冬雨，王英，王琿

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110847)

目的：探討安神方鎮(zhèn)靜催眠作用及其可能機(jī)制。方法：觀察安神方對小鼠自主活動的影響、對戊巴比妥鈉閾劑量下小鼠入睡潛伏期及睡眠時間的影響；通過觀察安神方對失眠大鼠全腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT、5-HIAA的影響，探討其抗失眠的可能機(jī)制。結(jié)果：與對照組比較，安神方中、高劑量組能明顯減少小鼠自主活動(P<0.05)；明顯縮短小鼠入睡時間(P<0.01)，延長小鼠睡眠時間(P<0.01)；與模型組比較，安神方中、高劑量組明顯升高失眠大鼠腦內(nèi)5-HT含量(P<0.05)、降低失眠大鼠腦內(nèi)DA(P<0.05，P<0.01)的含量。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)條件下，安神方有一定的鎮(zhèn)靜催眠作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。

失眠；自主活動；5-HT；NE；DA；5-HIAA

失眠通常指患者對睡眠時間和(或)質(zhì)量不滿足并影響白天社會功能的一種主觀體驗(yàn)，包括入睡困難、時常覺醒和(或)晨醒過早，可引起人的疲勞感、不安、全身不適、無精打采、反應(yīng)遲緩、頭痛、記憶力不集中等癥狀，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量和工作效率?！秲?nèi)經(jīng)》中稱失眠為“目不瞑”“不得眠”“不得臥”，并認(rèn)為失眠原因主要有兩種，一是其他病癥影響，如咳嗽、嘔吐、腹?jié)M等，使人不得安臥；二是氣血陰陽失和，使人不能寐。中醫(yī)藥通過調(diào)整人體臟腑氣血陰陽的功能能明顯改善睡眠狀況，且有不引起藥物依賴及醫(yī)源性疾患的特點(diǎn)[1-3]。安神方是多年的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有補(bǔ)益肝腎、養(yǎng)血安神的功效，常用于治療失眠多夢等癥，療效顯著。本實(shí)驗(yàn)通過小鼠行為藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)探討其鎮(zhèn)靜催眠作用，并通過高效液相色譜法檢測安神方對失眠大鼠腦組織內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響，探討其鎮(zhèn)靜催眠的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級KM雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(遼)2010-0001；SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量200～220 g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供許可證號：SCXK(遼)2010-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

安神方由酸棗仁、夜交藤、黃精等藥材組成，以上藥材均購于安國市康達(dá)中藥材有限公司，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院劉桂芳教授鑒定為《中華人民共和國國家藥典》2010年版一部所收錄的品種。實(shí)驗(yàn)所需藥材統(tǒng)一購買，分批進(jìn)行制備樣品，按處方比例取藥材780 g加6倍50%乙醇提取2次，每次2 h，合并回收乙醇濾過濃縮至一定濃度作為實(shí)驗(yàn)用藥，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑

對氯苯丙氨酸(PCPA， Sigma公司，批號1001542324 )；NE(Sigma公司，批號1001504415)；DA(Sigma公司，批號101305078)；5-HT(Sigma公司，批號1001528058)；5-HIAA(Sigma公司，批號100260296)；戊巴比妥鈉(中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司，批號F20030816)；地西泮片(北京益民藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H11020898)；甜夢膠囊(煙臺榮昌制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z37020040)。

1.4 主要儀器

ZZ-6小鼠自主活動儀(成都泰盟科技有限公司)；勻漿器(WIGGENS，D-130)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司，JY92-IIN)；低溫高速離心機(jī)(Eppendorf，5084R)；1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)。

2 方法

2.1 安神方對小鼠自主活動的影響

SPF級KM雄性小鼠，正常飼養(yǎng)觀察3天，隨機(jī)分為6組，各組按表1相應(yīng)的藥物及劑量(每日生藥量)分別灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d，于第8 d再給藥1次，給藥后55 min，將小鼠置于實(shí)驗(yàn)箱中先適應(yīng)5 min，然后開始計時記錄15 min內(nèi)的小鼠活動次數(shù)。

2.2 安神方對小鼠戊巴比妥鈉睡眠時間的影響

方法[4],SPF級KM雄性小鼠，正常飼養(yǎng)觀察3天，隨機(jī)分為7組，各組按表2相應(yīng)的藥物及劑量(每日生藥量)分別灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d，第8 d再給藥1次，給藥后1 h，各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(42 mg/kg)，睡眠以翻正反射消失為指標(biāo)(將動物背朝下仰臥于平板上，若動物保持此姿式30 s以上，則認(rèn)為翻正反射消失)，立即觀察記錄入睡潛伏期(腹腔注射至翻正反射消失的時間)和睡眠持續(xù)時間(翻正反射消失至恢復(fù)的時間)。

2.3 安神方對大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響

2.3.1 分組及給藥

分組：SD雄性大鼠正常飼養(yǎng)觀察3天，按體質(zhì)量隨機(jī)分為7組：正常對照組、模型組、地西泮組、甜夢膠囊組、安神方低、中、高劑量組。造模及給藥：各組按表3相應(yīng)的藥物及劑量(每日生藥量)分別灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d，于第6、7 d給藥同時腹腔注射對氯苯丙氨酸(PCPA，300 mg/kg)，正常對照組腹腔注射同體積的弱堿性生理鹽水，連續(xù)注射2天。

2.3.2 腦組織取材及處理[5-7]

于第7 d晚上禁食供水12 h，第8 d上午腹腔注射烏拉坦(25%，4 mL/kg)麻醉后斷頭，在冰面上迅速取出大腦，稱重，加入等體積的組織裂解液(0.1 M的高氯酸，含0.5 mmoL/L的Na2EDTA，0.1 g/L的半胱氨酸)，冰浴勻漿,待沒有組織塊，放入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中冰浴超聲3 min(30%強(qiáng)度，40℃)；4℃ 10000轉(zhuǎn)離心15 min，取上清相同條件下繼續(xù)離心15 min，取上清超濾后進(jìn)樣。

2.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：pH值3.03緩沖液(含1 mmol/L庚烷磺酸鈉；30 mmoL/L磷酸二氫鈉-磷酸溶液)-甲醇(89∶11)；流速1.0 mL/min；柱溫：25 ℃，進(jìn)樣量30L。熒光檢測器：激發(fā)波長：280 nm，發(fā)射波長：330 nm。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 安神方對小鼠自主活動的影響

如表1所示，與正常對照組比較，地西泮組給藥后能明顯減少小鼠自主活動次數(shù)(P<0.01)，安神方中劑量、高劑量組, 能明顯減少小鼠自發(fā)活動的次數(shù),與正常對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 安神方對小鼠自主活動的影響±s)

注：與正常對照組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 安神方對小鼠戊巴比妥鈉睡眠時間的影響

如表2所示，與正常對照組比較，地西泮組及安神方中、高劑量組能明顯縮短小鼠入睡潛伏期，同時明顯延長小鼠睡眠時間(P<0.01)；甜夢膠囊組能明顯延長小鼠睡眠時間(P<0.01)。

3.3 安神方對失眠大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

圖1為四種神經(jīng)遞質(zhì)高效液相色譜圖，此條件下供試品溶液中的各神經(jīng)遞質(zhì)和雜峰相互間分離良好。

表2 安神方對小鼠戊巴比妥鈉睡眠時間的影響±s)

注：與對照組比較,#P<0.05，##P<0.01。

圖1 四種神經(jīng)遞質(zhì)的高效液相色譜圖注：A:標(biāo)準(zhǔn)品圖；B：樣品圖；1：NE；2：DA；3：5-HATT；4：5-HT。

如表3所示，模型組的5-HT含量極大減少(P<0.01)和DAT含量明顯增加(P<0.05)。給藥后安神方中劑量、高劑量組能明顯升高失眠大鼠腦內(nèi)5-HT的含量、降低失眠大鼠腦內(nèi)DA的含量，與模型組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。

表3 安神方對大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響±s)

注：與對照組比較,#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用的自主活動實(shí)驗(yàn)和催眠實(shí)驗(yàn)是鎮(zhèn)靜催眠類藥物藥理學(xué)研究中常用的行為藥理學(xué)試驗(yàn)方法，小鼠自主活動實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明安神方能明顯減少小鼠自主活動次數(shù)。戊巴比妥鈉為中時作用的催眠藥，通過抑制腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激活系統(tǒng)達(dá)到鎮(zhèn)靜催眠作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，安神方能縮短小鼠入睡潛伏期，延長睡眠時間，說明其具有明顯的協(xié)同戊巴比妥鈉鎮(zhèn)靜催眠作用。

醫(yī)學(xué)研究證明，睡眠與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)某些特定結(jié)構(gòu)、特定神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，刺激動物丘腦或腦干一些結(jié)構(gòu)可誘發(fā)睡眠。在延腦和腦橋網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)存在上行抑制系統(tǒng)，其活動具有對抗上行激活系統(tǒng)的作用，從而引起睡眠。此系統(tǒng)一方面接受來自軀體和內(nèi)臟感覺的上行沖動而誘發(fā)睡眠，另一方面又接受前腦的梨狀區(qū)、扣帶回和視前區(qū)等結(jié)構(gòu)的下行沖動而引起睡眠。而隨后大量的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),許多中樞神經(jīng)遞質(zhì)如5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)等參與睡眠機(jī)制的調(diào)節(jié)[8-10]。位于腦干中縫核群的5-羥色胺能神經(jīng)元，能向皮質(zhì)、下丘腦等部位廣泛投射。5-HT是參與攝食、體溫、睡眠-覺醒、情緒活動如抑郁、焦慮等行為調(diào)節(jié)的重要單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。5-HT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，分泌不足能引起大腦皮層興奮和抑制功能發(fā)生紊亂，從而導(dǎo)致睡眠時相慢波睡眠和快波睡眠發(fā)生了紊亂?？梢?-HT在睡眠的發(fā)生與維持中起重要作用，如破壞動物中縫核可使其完全失眠，幾天后，慢波睡眠逐漸恢復(fù)，但是快波睡眠消失[11]；5-HT通過5-HT2B受體作用時能促進(jìn)NREMs，而與5-HT2A受體作用時則抑制NREMs[12]，提示5-HT可能通過不同的受體亞型來調(diào)節(jié)睡眠。5-HIAA是5-HT的代謝產(chǎn)物，其含量變化能反映出5-HT代謝情況。腦內(nèi)的 NE 能神經(jīng)元的細(xì)胞體主要位于延髓與腦橋，而NE、DA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其含量增高時，可以直接興奮中樞引起睡眠障礙。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,失眠是由于各種內(nèi)外因素導(dǎo)致五臟氣血陰陽失調(diào)致心神失養(yǎng)或不安而失眠,其病位在心，但與肝腎陰虛關(guān)系密切[13-18]。安神方由酸棗仁、夜交藤、黃精、天麻等組成，具有補(bǔ)益肝腎的功效，用于失眠的治療，療效顯著?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)[19]，天麻素能延長小鼠睡眠時間；酸棗仁有養(yǎng)肝、寧心安神的功能，作用溫和，常用于虛煩不眠、頭暈眼花等癥，并認(rèn)為酸棗仁中的黃酮類、皂苷類化合物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)起主要作用;夜交藤有誘導(dǎo)睡眠、縮短入睡潛伏期的作用;黃精具有增強(qiáng)免疫力、抗疲勞，抗氧化，延緩衰老，改善學(xué)習(xí)記憶力的作用。

大鼠注射PCPA 致失眠模型是目前國內(nèi)外比較公認(rèn)的動物失眠模型。從本實(shí)驗(yàn)看，大鼠注射PCPA 后腦內(nèi)5-HT含量明顯降低、5-HIAA含量未檢出、DA 含量顯著升高，NE變化不大，與文獻(xiàn)報道一致，證明造模成功。安神方中、高劑量組用藥后大鼠腦內(nèi)5-HT含量升高、DA 含量下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明安神方中、高劑量組能明顯升高失眠大鼠腦內(nèi)5-HT的含量、降低失眠大鼠腦內(nèi)DA的含量，推測其鎮(zhèn)靜催眠作用可能通過影響腦內(nèi)5-HT及DA的含量來實(shí)現(xiàn)。至于安神方鎮(zhèn)靜催眠作用是否與其他中樞神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)有待于下一步研究。

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Sedative-hypnotic Effect and Its Mechanism of AnShenFang

WEI Xin-zhi，F(xiàn)AN Hui，WANG Qing-hua，MIN Dong-yu，WANG Ying，WANG Hui

(AffiliatedHospitalofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shenyang110847,China)

Objective:To discuss the sedative-hypnotic effect of AnShenFang and its possible mechanism. Methods:The effect of AnShenFang was observed in the spontaneous activity of mice，the sleep latency and sleep duration of mice when they were given pentobarbital sodium in threshold dose.Observe its effect on the brain monoamine neurotransmitters such as NE, DA, 5-HT and 5-HIAA rats with insomnia and explore its possible mechanism. Results: The experimental results showed that the AnShenFang could inhibit the spontaneous activity of mice(P<0.05)，shorten sleep latency(P<0.01) and prolong sleep time(P<0.01) in its medium and high dose groups compared with the control group.AnShenFang could significantly increase the 5-HT content in brain of insomnia rats(P<0.05) and could significantly reduce the DA content in brain of insomnia rats(P<0.05,P<0.01)in its medium and high dose groups compared with the model group. Conclusion: Under the experimental condition,AnShenFang has a sedative-hypnotic effect, and its mechanism may be related to regulating the monoamine neurotransmitters in rats’ brain.

Insomnia；Spontaneous activity；5-HT；NE；DA；5-HIAA

2014中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2014M551121)；遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(No.LZ2014043)

魏新智(1979-)，女，主管藥師,主要從事中藥藥理與毒理學(xué)研究工作。

2015-12-11

R285.5

A

1002-2406(2016)05-0048-04

修回日期：2015-12-30