李曉燕，陳維，陳文玲

(云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650031)

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健脾疏肝和胃方對(duì)功能性消化不良大鼠Cajal間質(zhì)細(xì)胞及胃排空的影響

李曉燕，陳維*，陳文玲

(云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650031)

目的:觀察健脾疏肝和胃方對(duì)功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D)大鼠胃排空(gastric emptying,GE)、c-Kit陽(yáng)性Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of cajal，ICC)及其表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法:將大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、健脾疏肝和胃方組、多潘立酮組，采用夾尾刺激法建立FD大鼠模型，連續(xù)給藥14天后，采用半固體營(yíng)養(yǎng)糊法觀察胃排空，胃高倍鏡下Cajal間質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)胃平滑肌組織kit mRNA表達(dá)，Western blot法檢測(cè)胃平滑肌組織kit表達(dá)。結(jié)果:與對(duì)照組相比，模型組胃排空延遲、胃底c-Kit 陽(yáng)性ICC表達(dá)顯著降低(P均<0.05)；與模型組相比，健脾疏肝和胃方組及多潘立酮組胃排空、c-Kit 陽(yáng)性ICC數(shù)量及表達(dá)顯著升高(P均<0.05)。結(jié)論:健脾疏肝和胃方組可以明顯增加FD大鼠胃底ICC表達(dá)，加快胃排空；上調(diào)ICC、提高大鼠胃排空率可能是健脾疏肝和胃方治療功能性消化不良的作用機(jī)制之一。

功能性消化不良；大鼠；健脾疏肝和胃方；Cajal間質(zhì)細(xì)胞

功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D) 是一種臨床常見的消化道疾病，發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，臨床治療藥物多樣，但病情容易反復(fù)。因此，尋找具有多靶點(diǎn)、療效確切、副作用小的防治藥物無(wú)疑是一項(xiàng)有意義的研究。

健脾疏肝和胃方是云南省名中醫(yī)帥燾教授臨床應(yīng)用多年的治療肝胃不和之腹痛的經(jīng)驗(yàn)方，前期的臨床觀察[1]發(fā)現(xiàn)療效較好。本研究以FD大鼠為觀察對(duì)象，從Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of cajal，ICC)、胃排空(gastric emptying，GE)的層面，研究該方治療FD的可能作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

40只SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、西藥組和中藥組，每組10只。正常對(duì)照組正常喂養(yǎng)，其余3組均按照參考文獻(xiàn)[2]采用郭氏夾尾激怒法制造FD大鼠模型。

1.2 藥物

健脾疏肝和胃方(枳實(shí)10 g，白術(shù)20 g，柴胡12 g，白芍10 g，木香10 g，香附10g，延胡索10 g，川楝子8 g，厚樸20 g，檳榔10 g等)，購(gòu)自云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科;多潘立酮片(西安楊森制藥有限公司，批號(hào)140107137)。藥物制備方法:將中藥材按傳統(tǒng)方法水煎并加熱濃縮成浸膏，置4℃冷藏備用。

1.3 試劑與儀器

Rabbit Anti-C-KIT(BA0467，美國(guó)Santa cruz公司)；PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)；熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；冷凍離心機(jī)(德國(guó)thermo公司)；JY3002 型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 給藥方法

造模結(jié)束后開始灌胃給藥，按照大鼠與人臨床用藥劑量、體型系數(shù)公式dB=dA×RB/RA×(WA/WB)1/3計(jì)算大鼠藥物劑量，中藥組給予健脾疏肝和胃生藥13.5 g/kg，陽(yáng)性藥物對(duì)照組給予多潘立酮1.0 mg/kg，模型組及正常對(duì)照組給予生理鹽水,每日1次，連續(xù)14天。給藥14天后禁食不禁水24 h。

2.2 樣本處理

參照文獻(xiàn)[3]制作半固體糊，冰箱冷藏，用時(shí)恢復(fù)至室溫。末次給藥2 h后各組給予灌入半固體糊，1.0 g/只，40 min后斷頭處死大鼠。打開腹腔，結(jié)扎賁門和幽門，取下整胃，用濾紙拭干后稱胃全重。沿大彎側(cè)切開胃，以蒸餾水沖洗胃內(nèi)容物，濾紙拭干后稱胃凈重。胃底部取胃壁全層大小約0.5 cm×0.5 cm 2塊，一塊置于2.5%戊二醛、液氮中，備電鏡檢測(cè)。一塊用10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片，片厚4 μm，烤片30 min，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，每次10 min。然后洗滌、修復(fù)液修復(fù)、浸泡，依次加入一抗、二抗，鏡下觀察，以棕黃色為陽(yáng)性反應(yīng)；PBS 沖洗，HE 染色、沖洗、酒精濾泡，中性樹膠封片觀察。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 按照公式計(jì)算胃排空

胃排空率(%)=[1-(胃全重-胃凈重)/腹腔注射量]×100%

2.3.2 胃平滑肌組織kit mRNA表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(Real-time PCR)，以GAPDH 為內(nèi)參，檢測(cè)kit的mRNA表達(dá)(步驟：提取組織總RNA-引物-逆轉(zhuǎn)錄cDNA-Real time PCR 反應(yīng)體系擴(kuò)增-目的基因相對(duì)mRNA表達(dá)水平分析)。

2.3.3 Western blot檢測(cè)胃平滑肌組織kit表達(dá)

提取蛋白樣品80 μg，SDSPAGE凝膠電泳分離，凝膠電泳儀初始電壓80 V，后提高電壓至100 V，用PVDF膜進(jìn)行蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移，用5%TBS-T脫脂奶粉封閉。用TBS-T漂洗液洗膜，加入用適當(dāng)漂洗液稀釋的抗體(c-kit為1∶200；β-actin為1∶5000)，4℃孵育過(guò)夜。TBS-T漂洗液洗膜3次，然后將PVDF膜移入另一新的雜交袋，加入漂洗液稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(c-kit 為1∶2000；β-actin為1∶10000)，37℃振蕩60 min，TBS-T漂洗液洗膜。加入化學(xué)發(fā)光劑曝光、顯影。蛋白圖像分析用IPP軟件對(duì)掃描圖象的目的條帶進(jìn)行分析。

2.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 基本情況

造模7天后，造模大鼠均有體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢、飲水、飲食量逐漸減少，毛發(fā)枯黃、不光滑等表現(xiàn)。

3.2 各組大鼠胃底ICC 表達(dá)比較

模型組大鼠胃底c-Kit mRNA及蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組明顯減少(P<0.05);中藥組與模型組相比陽(yáng)性表達(dá)增多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1及圖1～3。

3.3 胃排空

模型組大鼠胃排空率較正常對(duì)照組明顯減少(P<0.05);中藥組與模型組相比胃排空率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥組與西藥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 各組大鼠胃底ICC 表達(dá)比較

注:與正常組相比，1)P<0.05;與模型組相比，2)P<0.05。

圖1 免疫組化檢測(cè)FD模型大鼠胃底肌肉層c-kit蛋白變化注:圖中所示為藥物干預(yù)后各組大鼠胃底肌肉層的免疫組化照片，1為空白對(duì)照組大鼠胃底肌肉層(×100)，2為模型對(duì)照組(×100)，3為西藥對(duì)照組(×100)，4為中藥組(×100)。

圖2 Western Blot檢測(cè)FD模型大鼠胃底肌肉層c-kit含量

3.4 Western Blot檢測(cè)c-kit蛋白表達(dá)結(jié)果

上圖為四組大鼠在藥物干預(yù)后Western Blot檢測(cè)c-kit蛋白的表達(dá)含量結(jié)果膠片掃描圖片；下圖為采用Bio-Rad的Quantity one軟件分析膠片后的c-kit不同組間表達(dá)趨勢(shì)變化。

3.5 RT-PCR檢測(cè)c-kit mRNA結(jié)果

圖3 RT-PCR檢測(cè)FD模型大鼠胃底肌肉層c-kit mRNA含量變化

相較于空白對(duì)照組的SD大鼠，模型對(duì)照組的大鼠胃底肌肉層中Cajal細(xì)胞含量都明顯降低。Western Blot方法檢測(cè)顯示模型對(duì)照組的c-kit蛋白含量為空白對(duì)照組的21.2%(P<0.05，見圖2)，RT-PCR方法檢測(cè)模型對(duì)照組c-kit mRNA含量為空白對(duì)照組的7.8%(P<0.05，見圖3)，免疫組化檢測(cè)顯示c-kit含量在模型對(duì)照組的SD大鼠胃底肌肉層的含量明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)(見圖1)，這說(shuō)明SD大鼠的FD模型構(gòu)建比較成功。而在藥物干預(yù)14天后，相較于模型對(duì)照組，西藥組和中藥組的大鼠胃底肌肉層的c-kit蛋白，c-kit mRNA，以及Cajal細(xì)胞含量都有所提升。其中西藥組的c-kit蛋白含量提升為239%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中藥組提升為139%(P<0.05)，如圖2中所示；西藥組的c-kit mRNA含量提升為331%(P<0.05)，中藥組提升為159%(P<0.05)，見圖3；免疫組化照片顯示西藥組和中藥組大鼠胃底肌肉層中的Cajal細(xì)胞的含量也較于模型對(duì)照組有所提升(圖1)。中藥組較西藥組低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

4 討論

FD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，研究顯示30%～80% 的FD 患者存在消化道運(yùn)動(dòng)障礙[4]。目前已證實(shí)ICC 在胃腸電生理和動(dòng)力發(fā)生及動(dòng)力障礙機(jī)制上具有重要作用[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠胃竇c-Kit 陽(yáng)性ICC與對(duì)照組比較明顯減少(P<0.05)，并且胃排空率明顯降低，ICC數(shù)量下降可能導(dǎo)致胃腸平滑肌松弛，胃蠕動(dòng)減弱，從而出現(xiàn)胃排空時(shí)間延長(zhǎng)等功能障礙。用健脾疏肝和胃方治療后，大鼠c-Kit mRNA及蛋白陽(yáng)性表達(dá)均較模型組增加、胃排空率顯著升高(P均<0.05)。中藥組與模型組相比各項(xiàng)指標(biāo)升高且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上，健脾疏肝和胃方促進(jìn)胃排空，可能通過(guò)上調(diào)ICC表達(dá)有關(guān)，但可能還存在其他作用機(jī)制，有待于今后進(jìn)一步研究。

[1] 李曉燕，石穎．健脾疏肝和胃法治療功能性消化不良42例[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2012,20(3)：128-129.

[2] 郭海軍,林潔,李國(guó)成,等.功能性消化不良的動(dòng)物模型研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2001,9(3):141-142.

[3] 孫永順，尚盈盈，朱生樑.丁香降氣方對(duì)反流性食管炎大鼠胃排空及Cajal間質(zhì)細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].新中醫(yī)，2012，44(10)：130-133.

[4] 張曉光，胡品津，林金坤，等.功能性消化不良患者胃感覺運(yùn)動(dòng)功能的研究[J].中華消化雜志，2003，23(4) :227-229.

[5] Daniel EE. Communication between interstitial cells of Cajal and gastrointestinal muscle[J].Neuro gastroenterol Motil，2004，16(1):118.

Effect of Jianpi Shugan Hewei Decoction on Expression of Interstitial Cells of Cajal in Functional Dyspepsia Rats

LI Xiao-yan，CHEN Wei*，CHEN Wen-ling

(TheFirstAffiliatedHospitalofYunanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Kunming650031，China)

Objective:To observe the effect and mechanism of Jianpi Shugan Hewei decoction on expression of gastric emptying and interstitial cells of cajal(ICC) in functional dyspepsia(FD) rats. Methods:FD model was induced by moderately enraging the rats' tail. All rats were randomly divided into 4 groups:a control group，a model group，a Chinese herbology group and a western medicine group. Drugs were administrated for 14 days. ICC and GE were determined by immunohistochemical method. Gastric emptying was observed with phenolsulfonphthalein. Results:Compared with the control group，gastric emptying and the expression of ICC in the model group were obviously decreased (P<0.05). Compared with the model group，gastric emptying and ICC increased significantly in Chinese herbology group and western medicine group(P<0.05). Conclusion: Jianpi Shugan Hewei decoction may increase diet and water intake，promote ICC expression in FD rats and accelerate gastric emptying.

Functional dyspepsia;Rats;Jianpi Shugan Hewei decoction;Interstitial cells of Cajal

云南省教育廳課題(No.2013Y235)

李曉燕(1975-)，女，副教授，主要從事脾胃病及老年病的臨床教學(xué)及科研工作。

陳維*(1979-)，男，講師，主治醫(yī)師，博士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)科學(xué)臨床、科研與教學(xué)工作。

2015-10-21

R285.5

A

1002-2406(2016)05-0045-03

修回日期：2015-11-10