李芊綿, 王超，范越，田明，李芳，高士平,國紫薇

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

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黃芪桂枝五物湯對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠NGF mRNA和VEGF mRNA表達(dá)的影響

李芊綿, 王超，范越*，田明，李芳，高士平,國紫薇

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：觀察黃芪桂枝五物湯對糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)大鼠坐骨神經(jīng)組織中生長因子(NGF)和血管內(nèi)皮因子(VEGF)mRNA表達(dá)的影響，初步探討黃芪桂枝五物湯治療DPN的機(jī)制。 方法：采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)制備大鼠糖尿病模型，用黃芪桂枝五物湯連續(xù)灌胃8周，分離坐骨神經(jīng)組織,采用半定量PCR法測定大鼠坐骨神經(jīng)中NGF mRNA與VEGF mRNA相對表達(dá)量。結(jié)果：黃芪桂枝五物湯能顯著提高NGF mRNA的表達(dá)量，降低VEGF mRNA的表達(dá)，與模型對照組比較有顯著性差異。結(jié)論：黃芪桂枝五物湯對糖尿病周圍神經(jīng)病變的保護(hù)作用可能與加強(qiáng)NGF mRNA表達(dá)，減少代償性VEGF mRNA表達(dá)有關(guān)。

黃芪桂枝五物湯；糖尿病周圍神經(jīng)病變；NFG mRNA；VRGF mRNA

糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic Peripheral Neuropathy，DPN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，中醫(yī)將其歸為“血痹”“脈痹”范疇[1]。黃芪桂枝五物湯是治療血痹證的代表方劑，出自《金匱要略》卷上，由黃芪、桂枝、白芍、生姜、大棗組成，具有益氣通絡(luò)、和血通痹之效，中醫(yī)臨床常用于治療DPN[2-4]?，F(xiàn)代研究表明，DPN發(fā)病機(jī)制與生長因子合成和異常代謝途徑有關(guān)[5-6]。本文通過黃芪桂枝五物湯對大鼠糖尿病模型NGF、VEGF神經(jīng)因子mRNA表達(dá)量的研究，初步探討黃芪桂枝五物湯治療DPN的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

健康SD大鼠100只，雄性，體質(zhì)量200～250 g(由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評價(jià)中心提供)。

1.2 藥物

黃芪桂枝五物湯由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心自制，規(guī)格：含生藥1 g/ml； 甲鈷胺片，日本衛(wèi)才(中國)藥物有限公司，0.5 mg/片，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20030812。

1.3 試劑

鏈脲佐菌素(德國Sigma公司)；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)； DEPC(Sigma公司)；Trizol 試劑盒(Invitrogen公司)；SYBR PrimeScript RT-PCR 試劑盒(Takara公司)。

1.4 儀器

普通PCR儀(美國MJ，PTC-100)；凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP，GelDoc-It)；酸度計(jì)(美國Orion，310P-02)；精密天平(瑞士Mettler-Toledo，AB265-S)；紫外分光光度計(jì)(日本島津，UV-2401)；超純水儀(美國Millipore，Milli-Q)；熒光定量PCR儀(美國AB，ABI-7500)；低溫冰箱(日本SANYO，MDF-382E)；制冰機(jī)(美國Grant，XB70)；高速低溫離心機(jī)(德國Sigma，3-18K)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DPN大鼠模型的制備及分組

取SD大鼠100只，造模前隨機(jī)選取出15只，作為正常對照組，剩余大鼠腹腔注射STZ 70 mg/kg(由0.1 mol/ml檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液配制)，72 h后測定血糖變化，血糖≥16.7 mmol/L大鼠歸為模型組，編號，分別檢測動(dòng)物坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，正常對照組與模型組分籠飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食。10周后，再分別檢測模型組動(dòng)物坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，與之前比較，軸突縮小、神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低、結(jié)周脫髓鞘者歸為DPN模型組，共計(jì)45只。將45只DPN模型大鼠隨機(jī)均分為黃芪桂枝五物湯組(HQG)、彌可保組(MKB)、模型組，每組15只。給予灌胃給藥：HQG組5 g/(kg·d)；彌可保170 μg/(kg·d)，模型組給予等量蒸餾水。實(shí)驗(yàn)過程中大鼠自由飲水和進(jìn)食，連續(xù)灌胃給藥8周后，分別處死，分離坐骨神經(jīng)組織，迅速置于液氮中并保存于-80℃冰箱。

2.2 RNA提取

取坐骨神經(jīng)組織置于研缽中充分研磨，取100 mg組織中加入Trizol試劑1 ml,室溫靜置5 min，加入氯仿0.2 ml，充分振蕩15 s，并在室溫條件下靜置3 min。4℃ 12000 rpm離心15 min。取上清，移至新管并加入異丙醇0.5 ml，輕輕混勻，靜置10 min后，室溫12000 rpm離心10 min后棄上清。向沉淀中加入75%乙醇1 ml ，輕輕混勻。4℃ 7500 rpm離心5 min后棄上清將RNA樣品涼干，加入無RNA酶水20 μL溶解。

2.3 cDNA合成

經(jīng)25 μL 反轉(zhuǎn)錄體系:RNA 3 μL，Oligo(dT) 1 μL，dd H2O(DEPC 處理)9.5 μL，以上首先70℃孵育5 min，然后迅速放在冰上。5×Buffer 5 μL，d NTP(10 mmol/L)5 μL，Ribonuclease inhibitor 0. 5 μL，M-MLV RT 1 μL。以上 42℃ 孵育 60 min，然后 70℃ 10 min，將所得的cDNA 保存于-80℃低溫冰箱中備用。

2.4 半定量PCR測定NGF mRNA和VEGF mRNA表達(dá)[7]

采用半定量PCR法檢測坐骨神經(jīng)NGF mRNA和VEGF mRNA的表達(dá)。以軟件Primer5.0設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參基因通過半定量PCR法測定NGF mRNA與VEGF mRNA表達(dá)。引物序列：NGF擴(kuò)增引物：上游5′CAC TCT GAG GTG CAT AGC GT 3′，下游5′GCT TCA GGG ACA GAG TCT CC3′；VEGF擴(kuò)增引物：上游5′CAT GCG GAT CAA ACC TCA CC3′下游5′TCA CCG CCT TGG CTT GTC AC3′；β-actin擴(kuò)增引物：上游:：5 ′CAT TGC TGA CAG GAT GCA GAA G 3′ ，下游：5 ′GAG CCA CCA ATC CAC ACA GAG T3′。在PCR擴(kuò)增體系中，依次加入下列試劑：cDNA 2.0 μL、SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10 μL、PCR Forward Primer(10 μM) 0.4 μL、PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μL、ROX Reference Dye ∏(50×) 0.4 μL、滅菌蒸餾水6.8 μL。

PCR擴(kuò)增程序：變性 94℃ 30 s；退火 65℃ 35 s；延伸 72℃ 70 s，總計(jì)循環(huán) 30次。最后 1次72℃時(shí)延伸 10 min。收集反應(yīng)過程中熒光，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)開始儀器設(shè)定的閾值，計(jì)算每份樣品中NGF mRNA與VEGF mRNA達(dá)到閾值時(shí)的Ct值，計(jì)算得出相對原始濃度，使用內(nèi)參基因進(jìn)行矯正，進(jìn)而得出每份樣品中NGF mRNA與VEGF mRNA相對表達(dá)含量。

3 結(jié)果

3.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3.2 黃芪桂枝五物湯對大鼠坐骨神經(jīng)NGF mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)期間，有部分大鼠死亡，但減少數(shù)量在實(shí)驗(yàn)允許范疇內(nèi)。由表一數(shù)據(jù)得知，模型組大鼠坐骨神經(jīng)NGF mNRA表達(dá)明顯低于正常組(P<0.05)；HQG組、MKB組的mRNA表達(dá)高于模型組(P<0.05)，但低于正常組(P<0.05)。

表1 各組大鼠NGF mRNA表達(dá)的比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與MKB組比較，&P<0.05。

3.3 黃芪桂枝五物湯對大鼠坐骨神經(jīng)VEGF mRNA表達(dá)的影響

由表2數(shù)據(jù)得知，模型組大鼠坐骨神經(jīng)VEGF mRNA表達(dá)明顯高于正常組(P<0.05)；HQG組、MKB組表達(dá)低于模型組(P<0.05)，但顯著高于正常組(P<0.05)。

表2 各組大鼠VEGF mRNA表達(dá)的比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與MKB組比較，&P<0.05。

4 討論

在神經(jīng)組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成與表達(dá)若是降低，會(huì)直接導(dǎo)致神經(jīng)元和雪旺氏細(xì)胞[5]的生理功能減弱，進(jìn)而誘發(fā)DPN各類癥狀。NGF作為重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，存在于部分感覺神經(jīng)元及交感神經(jīng)元所在的細(xì)胞組織內(nèi)，能夠有針對性的保護(hù)、修復(fù)、再生神經(jīng)元，抑制神經(jīng)元凋亡，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育、分化等生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，DPN模型大鼠血液或者組織中NGF mRNA表達(dá)量通常降低。本研究中，模型組大鼠坐骨神經(jīng)中NGF mRNA表達(dá)相對量大幅降低，而黃芪桂枝五物湯組與彌可保組較模型組顯著升高，提示黃芪桂枝五物湯可通過促使神經(jīng)因子表達(dá)進(jìn)而保護(hù)、修復(fù)與再生周圍神經(jīng)。

VEGF既是血管通透性因子，也是誘導(dǎo)血管生長與形成、內(nèi)皮細(xì)胞增值與遷移的多功能因子。具有促進(jìn)軸突生長；提升神經(jīng)元、雪旺氏細(xì)胞存活率；促進(jìn)神經(jīng)內(nèi)血管與神經(jīng)再生等作用[8-11]。研究發(fā)現(xiàn)，治療過程中VEGF mRNA表達(dá)升高，推測由于高糖環(huán)境下VEGF發(fā)揮營養(yǎng)因子保護(hù)作用而代償性增加。 本研究中，模型組大鼠坐骨神經(jīng)中VEGF mRNA表達(dá)相對量大幅升高，而黃芪桂枝五物湯組與彌可保組較模型組低，提示黃芪桂枝五物湯能抑制神經(jīng)組織損傷，不需更多代償性的VEGF mRNA的表達(dá)，減輕了DPN損害程度。

綜上研究認(rèn)為，黃芪桂枝五物湯對糖尿病周圍神經(jīng)病變的保護(hù)作用可能與加強(qiáng)NGF mRNA表達(dá)與減少代償性VEGF mRNA表達(dá)有關(guān)。改變大鼠坐骨神經(jīng)組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)含量，可能是黃芪桂枝五物湯治療DPN機(jī)制之一。

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黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.H2015047)

李芊綿(1991-)，女，碩士研究生，主要研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與新藥研發(fā)。

范越*(1961-)，女，編審，主要研究方向：醫(yī)藥文獻(xiàn)研究。

2016-03-31

R285.5

A

1002-2406(2016)05-0042-03

修回日期：2016-04-15