劉家昌，孫燕妮，彭屹峰，劉淑清

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 200062)

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益氣補(bǔ)腎活血方對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠JNK和P38MAPK的影響

劉家昌，孫燕妮，彭屹峰，劉淑清*

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 200062)

目的：觀(guān)察益氣補(bǔ)腎活血方對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜JNK和P38MAPK的影響，探討益氣補(bǔ)腎活血方對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療機(jī)制。方法：以雷公藤多苷作為對(duì)照，采用益氣補(bǔ)腎活血方對(duì)AA大鼠進(jìn)行灌胃治療。觀(guān)測(cè)SD大鼠關(guān)節(jié)腫脹度，檢測(cè)滑膜JNK和P38MAPK的磷酸化表達(dá)水平。 結(jié)果：益氣補(bǔ)腎活血方不僅能明顯降低AA大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度，又能明顯降低AA大鼠滑膜JNK和P38MAPK的磷酸化表達(dá)水平。結(jié)論：益氣補(bǔ)腎活血方能明顯緩解RA的臨床癥狀，該復(fù)方可能通過(guò)下調(diào)JNK和P38MAPK磷酸化表達(dá)水平，達(dá)到治療RA的目的。

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；c-Jun氨基酸末端激酶；P38絲裂原活化蛋白激酶；佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠；益氣補(bǔ)腎活血方；雷公藤多苷

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種系統(tǒng)性炎性疾病，該病發(fā)病初期的主要病變部位是關(guān)節(jié)滑膜。滑膜細(xì)胞信號(hào)特異性地調(diào)控關(guān)節(jié)滑膜的生理變化。異常的滑膜細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜的病變，誘發(fā)RA，是其發(fā)病機(jī)制之一[1]。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑可介導(dǎo)細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)的多種生理病理反應(yīng)過(guò)程，是生物體內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)[2]。c-Jun氨基酸末端激酶(JNK)和P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)途徑是MAPK途徑的重要組成部分。近年來(lái)的研究表明，RA的發(fā)病機(jī)制之一是JNK和P38MAPK途徑的異常激活[3-4]。本實(shí)驗(yàn)以益氣補(bǔ)腎活血方干預(yù)治療AA大鼠，通過(guò)對(duì)治療前后JNK和P38MAPK表達(dá)水平的觀(guān)測(cè)，探討該復(fù)方對(duì)RA的療效及可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康5周齡雌性SD大鼠60只，體質(zhì)量(160±20)g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 藥物

益氣補(bǔ)腎活血方：由生黃芪，白芍，生白術(shù)，巴戟天，土鱉蟲(chóng)，骨碎補(bǔ)等組成。雷公藤多苷片(遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司，批號(hào)20140501)。

1.3 主要試劑及儀器

RIPA組織裂解液、麗春紅染色劑、BCA蛋白定量試劑盒、弗氏完全佐劑(FCA)、兔抗大鼠的JNK和P38MAPK抗體(美國(guó)Sigma公司)；電泳儀、自動(dòng)酶標(biāo)儀、離心機(jī)(德國(guó)Osterode公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及造模 見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)物分組及造模

2.2 給藥方法

給藥方式：灌胃。益氣補(bǔ)腎活血方按常規(guī)方法煎煮，并將藥物濃縮到不同濃度。各組所用藥物、濃度、數(shù)量、頻率、見(jiàn)表2。

表2 各組給藥方法

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 關(guān)節(jié)腫脹度(大鼠后足體積檢測(cè))

采用排水法。

2.3.2 滑膜JNK和P38MAPK的磷酸化表達(dá)水平

運(yùn)用免疫印跡法(WB)。

2.3.2.1 滑膜組織蛋白的提取及濃度測(cè)定

造模50天后，取大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織，與組織裂解液混合、離心，提取蛋白；用BCA法測(cè)定蛋白濃度。

2.3.2.2 目的蛋白電泳與WB檢測(cè) 步驟見(jiàn)表3。

表3 目的蛋白電泳與WB檢測(cè)

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 大鼠左后足體積變化

造模第1天，大鼠左后足體積組間比較無(wú)差異(P>0.05)；造模后第7～50天，大鼠左后足體積組間比較，各組均大于空白對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；造模后第50天，大鼠左后足體積組間比較，各治療組均小于模型組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；雷公藤組與中劑量中藥組比較，無(wú)顯著性差異(P>0.05)；各中藥治療組間比較，中劑量中藥組小于其他兩組，有顯著性差異(P<0.01)。見(jiàn)表4。

3.2 大鼠滑膜組織JNK的磷酸化表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組大鼠滑膜JNK的磷酸化表達(dá)水平高于空白組，表明AA大鼠的JNK磷酸化表達(dá)高于空白組。各中藥治療組大鼠滑膜JNK的磷酸化表達(dá)水平均低于模型組，提示益氣補(bǔ)腎活血方可明顯降低JNK的磷酸化表達(dá)。中劑量中藥組的JNK磷酸化表達(dá)水平低于另外兩治療組，提示中劑量是抑制JNK磷酸化表達(dá)的最適劑量。見(jiàn)圖1、表5。

表4 各組大鼠左后足體積變化情況±s)

注：與模型組比較，aP<0.01,bP<0.05；與空白組比較，cP<0.01,dP<0.05；與中劑量中藥組比較，eP<0.01,fP<0.05。

圖1 各組大鼠滑膜組織JNK的磷酸化表達(dá)

3.3 大鼠滑膜組織P38MAPK的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組大鼠滑膜P38MAPK的磷酸化表達(dá)水平高于空白組，表明AA大鼠的P38MAPK磷酸化表達(dá)高于空白組。各中藥治療組大鼠滑膜P38MAPK的磷酸化表達(dá)水平均低于模型組，提示益氣補(bǔ)腎活血方可明顯降低P38MAPK的磷酸化表達(dá)。中劑量中藥組的P38MAPK磷酸化表達(dá)水平低于另外兩治療組，提示中劑量是抑制P38MAPK磷酸化表達(dá)的最適劑量。見(jiàn)圖2、表5。

圖2 各組大鼠滑膜組織P38MAPK的磷酸化表達(dá)

組別NJNKP38MAPK雷公藤組101.074ac0.861ac空白組100.881a0.629a中藥中劑量組101.129ac0.802ac中藥低劑量組101.693bce0.954ace中藥高劑量組101.753ce1.219ce模型組101.807c1.267c

注：與模型組比較，aP<0.01,bP<0.05；與空白組比較，cP<0.01,dP<0.05；與中劑量組比較，eP<0.01,fP<0.05。

4 討論

成纖維樣滑膜細(xì)胞是關(guān)節(jié)滑膜的重要組成部分，可以分泌作用于滑膜細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的多種物質(zhì)，如化學(xué)趨化因子、促炎性細(xì)胞因子等。上述物質(zhì)分泌失衡，導(dǎo)致滑膜細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，引起關(guān)節(jié)滑膜的病理變化[5]。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑是廣泛存在于生物體內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)之一，可介導(dǎo)細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)的多種生理病理反應(yīng)過(guò)程。目前研究已證實(shí)的MAPK途徑有4條，即C-Jun氨基末端激酶(JNK)通路、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)通路、ERK5通路、P38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路。JNK和P38MAPK途徑是MAPK途徑的重要組成部分。JNK和P38MAPK可被多種因素激活(如白介素-1、腫瘤壞死因子-α、應(yīng)激等)，從而特異性地激活其信號(hào)通路途徑，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[6]。近年來(lái)的研究表明，JNK和P38MAPK途徑在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜中的活化明顯加強(qiáng)[7]，導(dǎo)致關(guān)節(jié)局部炎癥及骨質(zhì)破壞，是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要機(jī)制之一。

全國(guó)名老中醫(yī)陳湘君教授根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種以正虛為本，邪實(shí)為標(biāo)，全身屬虛，局部屬實(shí)的疾病。根據(jù)上述理論，我們從正虛人手，提出RA的主要治療原則是益氣健脾、補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)。據(jù)此治療原則，本研究篩選中藥對(duì)AA大鼠進(jìn)行干預(yù)治療。本課題組前期以益氣補(bǔ)腎活血方干預(yù)治療AA大鼠，顯示其有顯著治療效果。該復(fù)方可顯著降低AA大鼠體內(nèi)TNF-α和IL-1的水平[8]?？商岣逴PG(骨保護(hù)素)的水平，抑制RANKL(與骨破壞密切相關(guān)的細(xì)胞因子)的水平[9]。能上調(diào)白介素-10(IL-10)，下調(diào)白介素-17( IL-17)，達(dá)到了增強(qiáng)抗炎，抑制促炎效應(yīng)的作用，具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用[10]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AA大鼠滑膜JNK和P38MAPK的磷酸化表達(dá)高于正常對(duì)照組。各中藥治療組大鼠滑膜JNK的磷酸化表達(dá)水平均低于模型組，提示益氣補(bǔ)腎活血方可明顯降低JNK的磷酸化表達(dá)。中劑量中藥組的JNK磷酸化表達(dá)水平低于另外兩治療組，提示中劑量是抑制JNK磷酸化表達(dá)的最適劑量。各中藥治療組大鼠滑膜P38MAPK的磷酸化表達(dá)水平均低于模型對(duì)照組，提示益氣補(bǔ)腎活血方可明顯降低P38MAPK的磷酸化表達(dá)。中劑量中藥組的P38MAPK磷酸化表達(dá)水平低于另外兩治療組，提示中劑量是抑制P38MAPK磷酸化表達(dá)的最適劑量。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示益氣補(bǔ)腎活血方對(duì)大鼠滑膜JNK和P38MAPK的磷酸化表達(dá)水平均有抑制作用，其中，中劑量中藥組對(duì)大鼠滑膜JNK和P38MAPK的磷酸化表達(dá)抑制作用最強(qiáng)。該復(fù)方治療RA的機(jī)制可能為：通過(guò)抑制滑膜JNK和P38MAPK的表達(dá)，降低其水平，減少其激活，從而抑制JNK和P38MAPK轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化，減少炎癥因子的釋放，抑制滑膜異常增殖和骨質(zhì)侵蝕。本研究為中醫(yī)藥治療RA提供了一個(gè)新的研究方向：通過(guò)干預(yù)關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，達(dá)到治療RA的目的。

[1] Huang XY,Zhang XM,Chen FH,et al.Anti-proliferative effect of recombinant human endostatin on synovial broblasts in rats with adjuvant arthritis[J].European Journal of Pharmacology,2014,723:7-14.

[2] 馮作化.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2004:114.

[3] 孫大英,楊林,王婭南.P38絲裂原活化蛋自激酶在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的研究進(jìn)展[J].華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,8(3):315-318.

[4] Chen Q,Wei W. Effects and mechanisms of chaenomeles speciosa on collagen-induced arthritis in rats[J].Int Immtmopharmacol,2003,3(4):593-608.

[5] Erlman H,Pagliari LJ,Liu H,et al.Rheumatoid arthritissynovial macrophages express the Fas-associated deathdomain-like interleukin-1β-converting enzyme- inhibitory protein and are refractory to Fas-mediated apoptosis[J].Arthritis Rheum,2001,44(1):21-30.

[6] Weston CR,Davis RJ.The JNK signal transduction pathway[J].CurrOpin Genet Dev,2002 ,12(1):14-21.

[7] Schett G,Tohidast-Akrad M,Smolen JS,et al.Activation,differentialLocalization, and regulation of the stress-activated protein kinases, extracellular signal-regulated kinase, c-JUN N-terminal kinase, and p38 mitogen-activated protein kinase, in synovial tissure and cells in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,2000,43(11):250-2512.

[8] 劉淑清,陳湘君.益氣補(bǔ)腎活血方對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠白細(xì)胞介素-1和腫瘤壞死因子-α的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2009,15(5):67-69.

[9] 劉淑清,陳湘君.益氣補(bǔ)腎活血方對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠OPG和RANKL的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2012,9(30):2091-2093.

[10] 劉淑清,陳湘君.益氣補(bǔ)腎活血方對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠IL-10和 IL-17的影響[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎,2013,2(12):26-29.

Effects of Yiqi Bushen Huoxue Decoction on JNK and P38MAPK in Rats with Adjuvant Arthritis

LIU Jia-chang,SUN Yan-ni,PENG Yi-feng,LIU Shu-qing*

(PutuoHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200062,China)

Objective: To observe the effect of Yiqi Bushen Huoxue decoction on JNK and P38MAPK in rats with adjuvant arthritis (AA),in order to investigate the treatment mechanism of Yiqi Bushen Huoxue decoction on rheumatoid arthritis(RA).Methods:With the tripterygium glycosides as the control drug,the AA rats received gavage treatment of Yiqi Bushen Huoxue decoction.Observe the joint swelling degree of SD rats and detect the phosphorylated expression level of JNK and P38MAPK in the synovial tissue. Results:Yiqi Bushen Huoxue decoction could significantly reduce the joint swelling degree of AA rats. In addition,it could reduce the phosphorylated expression level of JNK and P38MAPK in the synovial tissue. Conclusion:Yiqi Bushen Huoxue decoction can significantly relieve the clinical symptom of RA.In addition,our study also indicates that Yiqi Bushen Huoxue decoction may treat RA by increasing the level of JNK and P38MAPK.

Rheumatoid arthritis; c-Jun N-terminal kinase;P38 mitogen-activated protein kinases;Rats with adjuvant arthritis;Yiqi Bushen Huoxue decoction;Tripterygium glycosides

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院院級(jí)重點(diǎn)課題(No.2013ZD192)

劉家昌(1988-)，男，碩士研究生，主要研究方向：中醫(yī)藥治療風(fēng)濕病的臨床和實(shí)驗(yàn)研究。

劉淑清*(1973-)，女，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向：中醫(yī)藥治療風(fēng)濕病的臨床和實(shí)驗(yàn)研究。

2015-11-04

R285.5

A

1002-2406(2016)05-0039-03

修回日期：2015-12-01