藍昭軍,范明君,黃小林,趙 俊

1 廣東省水產健康安全養(yǎng)殖重點實驗室,廣東省高等學校生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室,廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測重點實驗室,華南師范大學生命科學學院,廣州 510631 2 韶關市水產研究所, 韶關 512006 3 深圳華大水產科技有限公司, 深圳 518083 4 中國水產科學研究院南海水產研究所, 廣州 510300

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基于線粒體Cytb基因的中國南方唇魚骨(Hermibarbuslabeo)和間魚骨(Hermibarbusmedius)種群分化及親緣地理研究

藍昭軍1,2,范明君1,3,黃小林1,4,趙 俊1,*

1 廣東省水產健康安全養(yǎng)殖重點實驗室,廣東省高等學校生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室,廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測重點實驗室,華南師范大學生命科學學院,廣州 510631 2 韶關市水產研究所, 韶關 512006 3 深圳華大水產科技有限公司, 深圳 518083 4 中國水產科學研究院南海水產研究所, 廣州 510300

為了解中國南方唇魚骨(Hermibarbuslabeo)和間魚骨(Hermibarbusmedius)的種群分化、親緣地理格局及物種有效性,作者對唇魚骨 8個水系及間魚骨 9個水系共148尾樣本的Cytb基因全序列進行了測定。在所有序列中,共有128個變異位點,共檢測出了41個單倍型,單倍型多樣性為0.954,核苷酸多樣性為0.02153?；贑ytb基因全序列構建的NJ樹顯示,中國南方的唇魚骨與間魚骨合聚為兩大支,其中韓江和九龍江的全部唇魚骨樣本組成了Ⅰ支,而其他水系的唇魚骨和間魚骨樣本則組成了Ⅱ支。兩支系間的遺傳距離為5.1%,而唇魚骨和間魚骨之間的遺傳距離為3.2%?，F(xiàn)有證據(jù)不支持間魚骨與唇魚骨達到種一級的分化。單倍型網(wǎng)絡圖顯示,韓江、九龍江種群和其他水系的種群分化較大；海南島三大水系種群和漠陽江種群的單倍型分支與代表珠江水系單倍型的分支之間的親緣關系較近,與其他地理區(qū)間種群的親緣關系則相對較遠；西江可能為珠江水系、漠陽江水系和海南島三大水系間魚骨種群的擴散中心,其中一支往東向北江和東江擴散；另一支往南向海南島擴散,海南島三大水系種群爾后在冰期海退時向北擴散至漠陽江水系及珠江水系。AMOVA分析表明,唇魚骨和間魚骨地理區(qū)之間變異約占54.50%,地理區(qū)內種群間變異約占18.64%,種群內的變異占26.86%,這說明,唇魚骨和間魚骨種群Cytb的遺傳分化主要是來自地理區(qū)之間。錯配分析及中性檢驗顯示,全部種群、唇魚骨種群、間魚骨種群在歷史上均沒有發(fā)生過明顯的擴張,兩個mtDNA支系亦未發(fā)生過擴張,而海南島的昌化江種群曾發(fā)生過種群擴張。

唇魚骨；間魚骨；種群分化；親緣地理；細胞色素b基因；中國南方

親緣地理學,又稱譜系生物地理學,是研究有密切親緣關系的種間和種內支系現(xiàn)有的地理分布格局的形成過程和形成機制的學科。生物在漫長的演化過程中,受各種因素(地質因素、氣候因素等)的影響,都會在其演化的過程中留下印跡,如影響生物的地理隔離、遷移、區(qū)域擴張和滅絕等,而生物的這些活動都會具有影響一定區(qū)域內物種基因流的作用,改變遺傳變異的分布,從而產生新的物種進化模式[1]。尤其是,地質地貌的格局對于種群基因流的改變和分化往往起著重要的作用[2- 6]。而分子親緣地理學是采用分子生物技術,在分子水平上探討物種的系統(tǒng)地理格局的形成機制,進一步闡述其起源進化歷史,分析區(qū)域類群在時間上和空間上的發(fā)展變化,從而重建生物區(qū)系的進化歷史過程[7]。

唇魚骨(Hemibarbuslabeo)和間魚骨(Hemibarbusmedius)均隸屬于鯉形目(Cypriniformes),鯉科(Cyprinidae),鮈亞科(Gobioninae),魚骨屬(Hemibarbus)[8- 9],兩者為近緣種。間魚骨是在原唇魚骨種群中劃分出的一個種[8],在此之前,一直被歸為唇魚骨[10- 14]。1995年,樂佩琦對我國魚骨屬魚類進行分類整理后認為,唇魚骨華南地區(qū)及西南部分地區(qū)的種群與唇魚骨其他地方種群的差別已經達到了物種級的水平,并以海南島的12尾標本作為模式標本,將華南及西南部分地區(qū)的唇魚骨種群描述為一新種——間魚骨(H.mediusYue),并指出其與唇魚骨的鑒別特征主要為吻長較短,唇稍薄,不甚發(fā)達,下唇側葉稍狹窄,無皺褶,背鰭刺較細弱及鰓耙數(shù)較少等[8]。1998年,樂佩琦等較為詳細地記載唇魚骨和間魚骨的地理分布,其中唇魚骨分布于我國臺灣各水系和閩江、錢塘江、長江、黃河等直至黑龍江水系；間魚骨分布于華南、西南部分地區(qū)各水系[9]。

然而,目前不同學者對于兩者的分布區(qū)域與樂佩琦等的觀點不盡相同[15- 18]。唇魚骨和間魚骨之間的鑒別特征較為模糊,且某些性狀可能存在連續(xù)變化,不易區(qū)分。因此,造成對兩者分布區(qū)描述差異的原因可能為物種鑒定存在偏差。此外,兩者的分布均較為廣泛,是研究親緣地理的理想素材。有關唇魚骨和間魚骨的親緣地理的研究,目前已有林宗鍵[17]及Lin等[18]基于線粒體控制區(qū)序列對唇魚骨的報道,但該研究并未涉及珠江等水系的種群。因此,作者在中國南方唇魚骨和間魚骨的分布區(qū),采集不同地理種群的樣本,對其線粒體細胞色素b(Cytb)基因序列進行了測定與分析,旨在澄清二者物種有效性的前提下,探討其種群分化和分布特征,推測其種群演化歷史及親緣地理模式。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究所用樣品均為2009年9月—2010年8月采自貴州省、廣西壯族自治區(qū)、廣東省、海南省、福建省、江西省和浙江省等地,所有樣本根據(jù)樂佩琦等提出的分類鑒定特征[8- 9]進行鑒定,其中間魚骨樣本共92尾；唇魚骨樣本56尾。將所有個體按所采樣的水系進行種群劃分,即用水系名稱對種群進行命名。具體的樣品信息及采樣點見表1。

1.2 DNA的提取及測序

基因組 DNA的提取參考慶寧等[19]的方法,即采用從上海生工生物工程技術服務有限公司購買的“基因組 DNA抽提試劑盒”所示方法,略有改動。PCR反應體系：反應體系約25μL,按順序分別將PCR Master Mix 12.5μL、Primer1 3μL、Primer2 3μL、模板DNA 4μL及滅菌雙蒸水2.5μL混合,每一次反應都用ddH2O代替模板DNA做陰性對照。反應在PTC100或PTC200型PCR儀上進行,具體擴增程序如下：A: 95℃預變性4min,B: 94℃變性40sec,C: 58℃退火45sec,D: 72℃延伸1min,E: 重復步驟B—D45次；F:最后72℃延伸10min。PCR及測序所用引物均為通用引物L14724和H15915,由上海英駿生物技術有限公司合成,其序列分別為：L14724：5′-GACTTG AAA AACCAC CGTTG- 3′；H15915：5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC- 3′。PCR產物用1%瓊脂糖電泳檢驗目的片段后,將PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司純化并測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對測得的序列使用Clustal X 1.81 軟件進行排序比對并輔以人工校對。用軟件MEGA 5.0[20]計算所分析序列的堿基組成。采用Kimura′s two-parameter模型計算遺傳距離,并采用該軟件中的鄰接法(Neighbor-joining method,NJ),以似鮈(Pseudogobiovaillanti)作為外類群,構建分支系統(tǒng)樹。用軟件DNAsp 5.0[21]對各種群序列的多樣性進行分析,統(tǒng)計核苷酸多樣性(Nucleotide diversity，π)與單倍型多樣性(Haplotype diversity,h),并以此估計不同水系種群的遺傳多樣性；并利用該軟件進行錯配分布(Mismatch-distribution)分析及Tajima′s D和Fu and Li′s檢驗,以檢驗種群是否發(fā)生過擴張。使用Network 4.6 軟件,以Median-joining法構建各單倍型之間網(wǎng)絡關系圖,并對圖中各個單倍型進行群體對應關系分析。利用Arlequin Ver 2000[22]軟件進行分子變異分析(AMOVA),測試種群間與地理區(qū)間遺傳變異程度。

2 結果與分析

2.1 Cyt b 基因的序列變異

本研究共得到148尾唇魚骨與間魚骨的Cytb基因全序列,序列長1140bp,無堿基的插入或缺失,Cytb基因所有序列中,共128個變異位點,占全序列的11.23%,其中14個為單個多態(tài)位點,114個為簡約信息位點。大多數(shù)的變異發(fā)生在密碼子第3位(82.81%),第1位(14.02%)和第2位(3.12%)的變異較低。唇魚骨與間魚骨在Cytb序列中A、C、T、G平均含量分別為27.5%、28.4%、28.4%和15.6%,G的含量明顯低于其他3種堿基含量,表現(xiàn)出很強的堿基組成偏向性。其中A+T的含量55.9%,G+C的含量為44.0%,A+T的含量明顯高于G+C的含量。

2.2 Cyt b 基因的單倍型多樣性和遺傳多樣性

在唇魚骨56尾樣本中,檢測出19個單倍型,其中17個為特有單倍型,2個為與間魚骨共享的單倍型；間魚骨92尾樣本,檢測出24個單倍型,其中22個為獨有單倍型,2個為與唇魚骨共享的單倍型(表1)。在全部148尾樣本中,共檢測出了41個單倍型,單倍型多樣性為0.954。

在一些不同的種群中,存在共享單倍型,表明這些種群的親緣關系十分密切。其中海南島三大水系之一南渡江(NAN)、廣東西部獨立入海水系漠陽江(MOY)及珠江水系第二大支流北江(BEI)的種群共享單倍型NAN1-MOY1-BEI5；西江支流桂江(GUI)和柳江(LIU)的間魚骨種群與長江水系支流湘江(XIA)的唇魚骨種群共享單倍型GUI1-LIU1-XIA1。

單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)分析表明(表1),148尾唇魚骨和間魚骨樣本的單倍型多樣性為0.954,核苷酸多樣性為0.02153,遺傳多樣性較高。核苷酸多樣性(π)分析表明(表1),湘江、桂江、北江、東江、九龍江、閩江種群的核苷酸遺傳多樣性較高,均在0.002以上。

2.3 種群間遺傳距離及遺傳分化

統(tǒng)計表明,唇魚骨和間魚骨之間的遺傳距離為3.2%,兩者遺傳差異不大。表2分別顯示了不同水系的唇魚骨與間魚骨基于Cytb基因的遺傳距離和及遺傳分化指數(shù)。由表2可知,在各地理區(qū)(如海南島地區(qū)、東南地區(qū)等)和水系內部(如長江水系和珠江水系)的遺傳距離、遺傳分化指數(shù)較低；珠江水系和長江水系的遺傳距離、遺傳分化指數(shù)亦較低。在唇魚骨和間魚骨各個種群之間,韓江、九龍江和閩江種群與其他各種群的遺傳距離較大,遺傳分化指數(shù)較高,而余下各種群之間的遺傳距離和遺傳分化指數(shù)則較低。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

為更好地了解中國南方地區(qū)唇魚骨與間魚骨各種群之間的親緣關系,以似鮈為外類群,對148尾樣品的Cytb基因中的41個單倍型進行系統(tǒng)發(fā)育分析,利用最大鄰接法(NJ)構建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。

在我國南方的唇魚骨與間魚骨種群間,聚成Ⅰ和Ⅱ兩支。韓江和九龍江的全部樣本組成了Ⅰ支,而其他水系的樣本則組成了Ⅱ支,支系Ⅰ和Ⅱ之間的遺傳距離為5.1%,這說明韓江和九龍江種群已和其他種群發(fā)生了一定程度的遺傳分化。在Ⅱ支中,又可分為A和B個兩姐妹群。A群包含了海南島三大水系、漠陽江、柳江、賀江、北江、錢塘江和甌江的全部樣本及桂江、東江、湘江和閩江的部分樣本；B群則包含了沅江的全部樣本及桂江、湘江和閩江的部分樣本。在支系Ⅱ的A群中,又可分為A1和A2兩個姐妹群。A1有兩個分支,分別為海南島三大水系、漠陽江的全部樣本和北江水系一尾樣本組成一個分支,說明海南島三大水系種群與漠陽江水系種群的親緣關系較近；而賀江、柳江的全部標本及湘江、北江和東江的部分樣本組成另一支,這則說明珠江水系三大支流之間的遺傳差異不大,而珠江水系與湘江水系之間的遺傳差異亦較低。A2則包含了錢塘江、甌江的全部樣本及閩江部分樣本和東江的一尾樣本。

就唇魚骨與間魚骨這兩個物種而言,除了支系Ⅰ全部為唇魚骨、A1其中的一個分支全部為間魚骨之外,其余均含有唇魚骨與間魚骨兩個物種,這也說明兩者間遺傳差異不大。

2.5 單倍型網(wǎng)絡分析

圖2顯示了中國南方唇魚骨和間魚骨基于Cytb基因的單倍型網(wǎng)絡親緣關系,大多數(shù)單倍型之間的變異為1—7步,遺傳差異不大。但是桂江和湘江種群的共享單倍型GUI2-XIA2與韓江和九龍江種群之間的變異近40步；桂江與錢塘江、甌江與閩江種群的變異達約20步,表明這些種群的單倍型間存在一定的遺傳分化。

物種Species水系Riversystems采集地Samplelocations樣品數(shù)Samplesize單倍型(個體數(shù))Haplotypes(numberofindividuals)變異位點數(shù)Numberofpolymorphicsites(S)單倍型數(shù)Numebrofhaplotypes單倍型多樣性Haplotypediversity(h)核苷酸多樣性Nucleotidediversity(π)間魚骨H.medius昌化江(CHJ)五指山10CHJ1(3)、CHJ2(2)、CHJ3(1)、CHJ4(1)、CHJ5(2)450.8670.00121南渡江(NAN)屯昌9NAN1-MOY1-BEI5*(9)010.0000.00000萬泉河(WAN)瓊海9WAN1(7)、WAN2(2)120.3890.00034漠陽江(MOY)陽春11NAN1-MOY1-BEI5(10)、MOY2(1)120.1820.00016東江(DON)河源10DON1(1)、DON2(1)、DON3(5)、DON4-HEJ1(3)*、2940.7110.00532北江(BEI)連州9BEI1(1)、BEI2(10)、BEI3(1)、BEI4(1)、1750.5060.00224始興5NAN1-MOY1-BEI5(1)賀江(HEJ)賀州11DON4-HEJ1(4)、HEJ2(7)120.5090.00045桂江(GUI)桂林6GUI1-LIU1-XIA1(4)*、GUI2-XIA2(1)*、GUI3(2)、3050.8060.00614荔浦3GUI4-LIU2(1)*、GUI5(1)柳江(LIU)從江3GUI1-LIU1-XIA1(3)、GUI4-LIU2(2)、LIU3(4)430.6670.00137永福6唇魚骨H.labeo韓江(HAN)上杭10HAN1(8)、HAN2(1)、HAN3(1)330.3780.00053九龍江(JIU)漳平5JIU1(2)、JIU2(3)120.6000.03072閩江(MIN)邵武9MIN1(2)、MIN2(1)、MIN3(1)、MIN4(2)、MIN5(3)4250.8610.01652湘江(XIA)全州9GUI1-LIU1-XIA1(6)、GUI2-XIA2(3)2720.5000.01184沅江(YUA)錦屏7YUA1(7)010.0000.00000信江(XIN)上饒3XIN1(2)、XIN2(1)120.6670.00058甌江(OUJ)麗水9OUJI(4)、OUJ2(5)220.5000.00088錢塘江(QIA)開化4QIA1(3)、QIA2(1)120.5000.00044合計Total148128410.9540.02153

﹡表示此單倍型為不同河流共享單倍型

表2 不同水系的唇魚骨與間魚骨Cyt b基因遺傳距離(對角線下方)和遺傳分化指數(shù)(% 對角線上方)

圖1 唇魚骨與間魚骨中國南方種群基于Cyt b基因的最大鄰接NJ樹Fig.1 Neighbor-joining tree of H.labeo and H.medius populations of south China based on Cyt b gene

圖2 唇魚骨與間魚骨中國南方種群基于Cyt b基因的單倍型網(wǎng)絡圖Fig.2 Minimum spanning network of Cyt b sequences of H.labeo and H.medius populations of south China

單倍型網(wǎng)絡圖還揭示,桂江及柳江水系種群與長江水系支流湘江水系種群的親緣關系十分密切,兩者具有共享單倍型且各個單倍型之間的變異不大；海南島三大水系的種群與漠陽江種群的親緣關系比較密切；錢塘江、甌江及閩江種群的親緣關系亦較為密切；韓江與九龍江種群的親緣關系較近；而我國東南部水系閩江的種群不僅與長江水系支流湘江、沅江的關系較近,且與珠江水系支流東江、長江水系支流信江種群的關系亦較密切。這與NJ樹的結果相似。從單倍型網(wǎng)絡圖推測,西江可能為珠江水系、漠陽江水系和海南島水系間魚骨種群的擴散中心,其中一支往東向北江和東江擴散；另一支往南向海南島擴散,海南島種群爾后在第四紀冰期海退時向北擴散至漠陽江水系及珠江水系。

2.6 分子變異分析(AMOVA)

為了解唇魚骨和間魚骨種群分子變異的分布模式,根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析及單倍型網(wǎng)絡分析的結果,將唇魚骨和間魚骨17個水系的種群分成5個地理區(qū),進行分子變異分析(AMOVA)。地理區(qū)的劃分主要根據(jù)各種群親緣關系的親疏及地理位置,其中海南島的南渡江、萬泉河、昌化江和漠陽江為一地理區(qū)；珠江水系為一地理區(qū),包括西江支流柳江、桂江、賀江、珠江另外兩條支流北江及東江；長江水系為一地理區(qū),包括湘江、沅江及信江；韓江和九龍江為一地理區(qū)；閩江、甌江和錢塘江為一個地理區(qū)。AMOVA分析分析表明,唇魚骨和間魚骨地理區(qū)之間變異約占54.50%,地理區(qū)內種群間約占18.64%,種群內的變異占26.86%(表3)。這說明,唇魚骨和間魚骨種群Cytb的遺傳分化主要是來自地理區(qū)之間。

2.7 種群動態(tài)分析

除了昌化江、桂江、北江、東江、閩江等種群外,其他種群的單倍型數(shù)目未達到4,故無法計算Fu and Li′s D和Tajima′s D值。對唇魚骨和間魚骨的全部種群、唇魚骨種群和間魚骨種群進行錯配分析發(fā)現(xiàn),全部種群、唇魚骨及間魚骨種群均呈現(xiàn)多峰分布,說明其均沒有發(fā)生過明顯的擴張。而中性檢驗也顯示,全部種群、唇魚骨及間魚骨種群的Fu and Li′s D和Tajima′s D值均沒有呈現(xiàn)顯著的負值,表明其在歷史上均沒有發(fā)生過明顯的擴張(表4)。表4還表明,兩個支系的Fu and Li′s D和Tajima′s D值均沒有呈現(xiàn)顯著的負值,這說明兩個支系亦未發(fā)生過擴張。

表3 唇魚骨和間魚骨分子變異分析

表4 唇魚骨與間魚骨種群基于Cyt b基因的Tajima′s D 和 Fu and Li′s D檢驗

就各個水系的種群而言,桂江、北江、東江、閩江等種群的Fu and Li′s D和Tajima′s D均不為顯著的負值,說明這幾個種群亦相對穩(wěn)定,沒有發(fā)生過擴張；而昌化江(CHJ)的Fu and Li′s D為顯著的負值,而Tajima′s D則不顯著,但其錯配分析圖為單峰分布(圖3),所以可以推測昌化江種群曾發(fā)生過種群擴張。

圖3 昌化江種群的歧點分布分析圖(其中實線代表期望值,虛線代表觀察值)Fig.3 Mismatch-distribution analysis of H.medius of Changhuajiang population of mtDNA haplotype sequences(solid lines represent the distribution expeted under constant population size, and dotted lines represent the observe distribution)

3 討論

3.1 間魚骨物種有效性

在本研究中,遺傳距離分析表明,唇魚骨和間魚骨之間的遺傳距離為3.2%,低于唇魚骨種內各種群間的最大遺傳距離(韓江與信江,5.9%)。系統(tǒng)分析顯示,間魚骨并未形成單系群,而是與部分唇魚骨種群組成一支,而韓江和九龍江的唇魚骨組成了另一支。單倍型分布分析顯示,湘江唇魚骨種群的所有單倍型均與桂江或柳江的間魚骨種群共享,湘江、桂江和柳江種群的遺傳差異極小。系統(tǒng)發(fā)育分析及單倍型網(wǎng)絡圖還顯示,除了唇魚骨的湘江、沅江種群與間魚骨的桂江、柳江種群的親緣關系較近外,唇魚骨的信江和閩江種群與間魚骨的東江種群亦有著較近的親緣關系。此外,藍昭軍基于多變量形態(tài)度量學的研究亦表明,唇魚骨和間魚骨存在一定的形態(tài)差異,但各個種群間存在梯度變異,差異并不顯著,無法截然分開[23]；而林龍峰基于線粒體CO I和ND5基因分別對中國南方唇魚骨與間魚骨的種群遺傳分化進行了研究,結果均表明間魚骨與唇魚骨之間的遺傳差異較小,兩者存在共享單倍型,且間魚骨不能單獨構成單系群,而是與唇魚骨部分樣本構成一個分支[24]。因此,綜合考慮基于線粒體Cytb、CO I和ND5基因和多變量形態(tài)度量學的分析結果,我們認為唇魚骨和間魚骨之間的遺傳差異未達到種級水平,間魚骨應為唇魚骨的次定同物異名。

3.2 韓江、九龍江種群與其他種群間的遺傳分化

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,在我國南方的唇魚骨與間魚骨種群間,可以分成Ⅰ和Ⅱ兩支。韓江和九龍江種群遺傳差異不大,兩條江的全部樣本組成了Ⅰ支,而其他種群的樣本則組成了Ⅱ支,兩支系之間的遺傳距離為5.1%,這說明韓江和九龍江種群已和其他種群發(fā)生了一定程度的遺傳分化。林弘都[25]和梁曉旭等[26]對部分淡水魚類的研究亦表明,華南大陸東部的蓮花山脈是粵東地區(qū)的一個重要地理屏障,而慶寧等[27]對華南地區(qū)黑眶蟾蜍(BufoMelanostictus)的研究亦得出了相似的結果。

韓江是廣東省東部地區(qū)的最大河流,其有東西兩源,東源稱梅江,發(fā)源于蓮花山山脈北麓；西源稱汀江,發(fā)源于武夷山南麓。蓮花山脈位于廣東省東北部,其山勢由粵北部的大埔向西南一直延伸到香港附近,最高峰為銅鼓障,高1559 m; 整個山脈高度基本在980—1 170 m之間[28]。九龍江為福建省第二大水系,發(fā)源于福建玳瑁山南麓。由此可知,韓江和九龍江被蓮花山、武夷山、玳瑁山等較高的山脈圍繞,將其與珠江水系、長江水系及閩江水系隔離。據(jù)此,我們推測：一方面,由于蓮花山、武夷山、玳瑁山等山脈的隔離,韓江和九龍江的種群無法與其他種群進行基因交流,因而產生了相對較大的遺傳分化；另一方面,韓江和九龍江在冰期海退時,可能曾發(fā)生過連接,使得兩種群之間得以基因交流,因而遺傳差異不顯著。

3.3 珠江及長江種群間的遺傳分化

分子系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,除湘江與桂江和柳江種群的親緣關系較近以及東江少數(shù)樣本與信江、閩江種群的親緣關系較近外,唇魚骨和間魚骨剩下的絕大部分單倍型則分別歸入了不同的分支之內。這表明,在唇魚骨和間魚骨分布區(qū)之間,可能存在地理障壁,造成其不同的分布范圍,而這一地理障壁可能為長江水系和珠江水系的分水嶺之一——南嶺山脈。南嶺山脈由越城嶺、都龐嶺、萌渚嶺、騎田嶺和大庾嶺5條主要山嶺所組成。其橫亙在湘桂、湘粵、贛粵之間,向東延伸至閩南,東西長約600km,南北寬約200km。廣義的南嶺還包括苗兒山、海洋山、九嶷山、香花嶺、瑤山、九連山等。有研究表明,南嶺山脈在11.06—8.04百萬年前已經形成[29],但在隆起初期,其高度相對較低,可能不足以阻隔兩側的淡水魚類的基因交流。而在青藏高原隆起的時期,南嶺山脈也呈加速隆起之勢[25]。南嶺的加速隆起,可能使其成為了南嶺以北水系與南嶺以南水系間的地理障壁,因而限制了南北兩側水系種群的基因交流,使得其兩側的種群產生了遺傳分化,進而形態(tài)上也發(fā)生了一定程度的分化。

在本研究中,多種分析結果亦顯示,長江水系支流湘江、沅江及信江的唇魚骨種群與珠江水系間魚骨種群的親緣關系較近,其中湘江與沅江的種群在系統(tǒng)發(fā)育樹中與桂江和柳江的親緣關系均較近；而東江的部分樣本則與信江種群的親緣關系較近。在Li等對馬口魚(Opsariichthysbidens)的研究[30]及Yang等對大鰭鳠(Hemibagrusmacropterus)的研究[31]中,其結果均顯示珠江水系的種群與長江水系的種群親緣關系較近。

我們推測,造成這種情況的原因可能有二,一是由于地殼運動、洪水泛濫等原因,使長江水系和珠江水系在歷史上曾發(fā)生過襲奪事件或連接事件,使長江南部支流上游的部分支流被珠江襲奪或與珠江水系支流相連接,從而使兩水系種群得以基因交流；二是水利樞紐工程的影響,在湘江水系與桂江水系上游,有一條建成已有2200多年人工運河——靈渠將兩江聯(lián)通[32],這也可能促進長江水系與珠江水系種群的基因交流。

3.4 海南島種群的起源、擴散及隔離

從唇魚骨和間魚骨單倍型的分布可知,海南島的南渡江水系、廣東西部水系漠陽江及北江水系共享一個單倍型,表明三種群間親緣關系較近。在單倍型網(wǎng)絡圖中,單倍型WAN1與桂江、柳江和湘江的共享單倍型GUI1-LIU1-XIA1及桂江的單倍型GUI3之間的變異均較小,約為10步,表明這些單倍型間有著較近的親緣關系；萬泉河的單倍型WAN1與南渡江、漠陽江和北江的共享單倍型NAN1-MOY1-BEI5只有3步,兩者之間亦有著很近的親緣關系。此外,單倍型網(wǎng)絡圖還顯示,海南島中部山脈以東的南渡江和萬泉河種群與西邊的昌化江種群之間關系相對較遠(16步)。

有關華南沿海地質構造的研究顯示,在第四紀時,瓊州海峽至少經歷過4次海侵與海退[33]；而在第四紀冰期,由于海平面下降,華南沿海的海岸線在海南島以南,海南島北部均為遼闊的濱海平原[34]；在更新世,在海南島和越南之間是一片陸地,其間有一條聯(lián)系西江、廣西、越南沿海和海南島諸水系的古河道[35]。有鑒于此,結合本研究系統(tǒng)發(fā)育分析及單倍型網(wǎng)絡圖等研究結果,海南島的間魚骨種群有可能為西江水系的種群沿著上述這一古河道擴散而來,然后進一步在海南島內擴散。隨后,由于海平面的上升,海南島與大陸隔離,因而使海南島種群與大陸種群的基因交流受到了限制,發(fā)生了遺傳分化。而到了晚更新世冰期時,由于海退等原因,雷州半島與海南島連成一片山地丘陵[36],這使得海南島的種群得以向北擴散,到達雷州半島,進而擴散至漠陽江水系,并重新回到珠江水系。間魚骨的這一擴散途徑,與海南紋胸鮡(Glyptothoraxhainanensis)[37]及中間黃顙魚(Pelteobagrusintermedius)[38]有相似之處。

在林宗鍵和Lin等對唇魚骨的親緣地理研究中,基于線粒體控制區(qū)序列的分析結果顯示,海南島昌化江種群(實為間魚骨)與長江中游種群的親緣關系較其與廣東東部水系榕江種群的關系近,而昌化江與長江的距離遠大于其與榕江的距離,他們認為其原因是長江和海南島的水系曾通過古紅河水系發(fā)生過連接[17- 18]。值得指出的是,在Lin等的研究中,并沒有采集珠江水系的樣本,而海南島也只有昌化江水系的樣本。在本研究中,也發(fā)現(xiàn)海南島三大水系種群與長江水系種群的親緣關系近于其與韓江和九龍江水系種群的親緣關系。由于韓江與榕江的地理位置很近,故此該結果與Lin等的相似?？梢哉J為,造成本研究及Lin等所述之結果的另一重要原因是海南島的種群由西江水系種群沿著古河道擴散而來,而西江曾與長江水系發(fā)生過襲奪或連接事件,其種群與長江水系種群親緣關系較近。因此,這一現(xiàn)象進一步印證了我們對海南島種群來源及擴散之推測。

另一方面,在海南島內部,單倍型網(wǎng)絡圖顯示昌化江種群與萬泉河及南渡江種群的變異達到16步,說明昌化江種群與其他兩種群之間,發(fā)生了一定的遺傳分化。地質研究表明,在第三紀末期,海南島中部山地已經形成,在多雨山區(qū)發(fā)源的河流也四散分流,獨自入海,不相聯(lián)系匯合[39]。在間魚骨擴散至海南島各主要水系后,可能由于海南島中部山地,如五指山等的隆起,將海南島西部的昌化江種群與東部的萬泉河及南渡江種群隔離,進而使昌化江種群產生了分化。而左艷玲等基于線粒體DNA控制區(qū)序列對擬平鰍(Liniparhomalopteradisparis)的研究也表明：擬平鰍的昌化江種群與南渡江和萬泉河的種群亦存在較大的遺傳分化[40]。因此,本研究的結果進一步說明了海南島中部山脈可能對海南島的淡水魚類存在著較為廣泛的隔離。

致謝：華南師范大學陳湘粦教授和慶寧教授幫助實驗方案設計及修改,林弘都博士和張雄同學參與了部分樣品的采集,Radhakrishnan博士幫助寫作,特此致謝。

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Population diversity and phylogeography ofHemibarbuslabeoandHemibarbusmediusin South China

LAN Zhaojun1,2, FAN Mingjun1,3, HUANG Xiaolin1,4, ZHAO Jun1,*

1GuangdongProvincialKeyLaboratoryforHealthyandSafeAquaculture,KeyLaboratoryofEcologyandEnvironmentScienceinGuangdongHigherEducation,GuangzhouKeyLaboratoryofSubtropicalBiodiversityandBiomonitor,SchoolofLifeScience,SouthChinaNormalUniversity,Guangzhou510631,China2ShaoguanFisheriesResearchInstitute,Shaoguan512006,China3ShenzhenBGIFisheriesScience&Technologycorporation,Ltd,Shenzhen518083,China4SouthChinaSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Guangzhou510300,China

HemibarbuslabeoandHemibarbusmedius(Cypriniformes: Cyprinidae: Gobioninae:Hemibarbus) are primary freshwater fish species, and their wide distribution makes them ideal models for phylogeographical studies. In this study, variations in the population genetics and phylogeographical patterns of 148 specimens belonging to 8 populations ofH.labeoand 9 populations ofH.mediuscollected from 17 drainage systems in south China were investigated using the nucleotide sequences of the mtDNA Cytochromebgene (1140 bp). The results reveal 128 variable sites (11.23%) within the gene sequences ofH.labeoandH.medius. A total of 41 haplotypes were identified, with the haplotype diversity (h) and nucleotide diversity (π) being 0.954 and 0.02153, respectively. This indicates a high level of genetic diversity and evolutionary potential in both species. The results of the neighbor-joining tree demonstrate thatH.labeoandH.mediusindividuals fall into two major clades (clade I and clade II): clade I is composed of all specimens collected from the Hanjiang and Jiulongjiang Rivers, all of which were identified asH.labeo. Meanwhile, all remaining populations fell into clade II, which includes specimens of bothH.labeoandH.medius. The genetic distance between clade I and clade II was 5.1%, while that betweenH.labeoandH.mediuswas 3.2%. Our results indicate that the specimens collected from these sampling localities may not be differentiated into two or more subspecies. The haplotype network indicates that the populations of the Hanjiang and Jiulongjiang Rivers exhibit a relatively high level of genetic variation compared to that of the rest of the rivers in the region, and that the populations from Hainan Island and Moyangjiang River were genetically close to those from the Pearl River System, but not to those from the Yangtze River System,Hanjiang River, Jiulongjiang River, Minjiang River, Oujiang River and Qiantangjiang River. TheH.mediuspopulations of south China seem to have originated from the Xijiang River and reached south China by one of two routes: one route may be through the Xijiang River to the Beijiang and Dongjiang rivers; and the other may be though the southern Guangxi drainages to Hainan Island, and then to the Moyangjiang and Beijiang rivers through the Qiongzhou Strait. According to the neighbor-joining tree and the haplotype network, five regions of genetic distribution were defined: Hainan Island and the Moyangjiang River region; the Pearl River region; the Yangtze River region; the Hanjiang and Jiulongjiang river region; and the Minjiang, Oujiang, and Qiantangjiang river region. An analysis of molecular variance (AMOVA) showed that the genetic variation of populations among regions was 54.50%; conversely, the genetic variation among populations within regions was 18.64%, and that within the populations of different regions was 26.86%. This indicates that the greatest genetic variation is found among the populations of the different regions. Mismatch distribution and tests of neutrality taking populations ofH.labeoandH.mediusinto account both together and separately were all multimodal types, and the value of Fu, Li′s D, and Tajima′s D for all comparisons were all negative but non-significant or positive. The results reveal relatively stable populations ofH.labeoandH.medius. Mismatch distribution and tests of neutrality also showed that both clade I and clade II were relatively stable; however, the population of the Changhuajiang River has undergone an obvious population expansion.

Hemibarbuslabeo;Hemibarbusmedius; population diversity; phylogeography;Cytochromebgene; South China

國家自然科學基金項目(31372178)；公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項經費資助(201303048)；廣東省科技計劃項目(2015A070706009)

2014- 11- 04;

日期:2016- 01- 15

10.5846/stxb201411042169

*通訊作者Corresponding author.E-mail: zhaojun@scnu.edu.cn

藍昭軍,范明君,黃小林,趙俊.基于線粒體Cytb基因的中國南方唇魚骨(Hermibarbuslabeo)和間魚骨(Hermibarbusmedius)種群分化及親緣地理研究.生態(tài)學報,2016,36(19):6091- 6102.

Lan Z J, Fan M J, Huang X L, Zhao J.Population diversity and phylogeography ofHemibarbuslabeoandHemibarbusmediusin South China.Acta Ecologica Sinica,2016,36(19):6091- 6102.