閆鐵夫 何曉楠 孫 健 王莉麗 付玉萍

(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院皮膚科，遼寧 錦州 121000)

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皮膚基底細胞癌及鱗狀細胞癌組織中分化抑制因子-1、血管內皮生長因子、凝血酶敏感蛋白-1、微血管密度表達狀況及意義

閆鐵夫 何曉楠 孫 健 王莉麗 付玉萍

(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院皮膚科，遼寧 錦州 121000)

目的 探討皮膚基底細胞癌(BCC)及鱗狀細胞癌(SCC)組織中分化抑制因子(ID)-1、血管內皮生長因子(VEGF)、凝血酶敏感蛋白(Tsp)-1及微血管密度(MVD)表達狀況及其臨床意義。方法 SCC及BCC患者各30例，取患者病理組織標本，另選取24例正常皮膚組織樣本作為對照組。應用免疫組化法測定各組織標本中ID-1，VEGF，Tsp-1和微血管標記抗體CD34的表達水平，計數腫瘤MVD；采用RT-PCR方法檢測ID-1、Tsp-1、VEGF mRNA表達情況；應用Western印跡方法檢查ID-1、Tsp-1、VEGF蛋白水平。結果 SCC組、BCC組及對照組MVD值及ID-1、VEGF、Tsp-1陽性表達率比較差異顯著(P<0.05)，兩兩比較，SCC組、BCC組與對照組比較均有統計學差異(P<0.05)，且A組、B組間MVD值存在統計學差異(P<0.05)。三組ID-1、VEGF及Tsp-1 mRNA及蛋白表達水平均有顯著差異(P<0.05)，兩兩組間比較也均有顯著差異(P<0.05)。結論 皮膚SCC、BCC的發(fā)病與ID-1、VEGF、Tsp-1和MVD密切相關，其中ID-1與VEGF存在協同關系，能夠促進腫瘤組織內血管生成，在皮膚SCC中表現更明顯。

ID-1；VEGF；Tsp-1；MVD；皮膚鱗狀細胞癌；基底細胞癌

臨床上非黑素性皮膚癌(NMSC)主要分為皮膚鱗狀細胞癌(SCC)與基底細胞癌(BCC)〔1〕。臨床治療的關鍵在于有效抑制腫瘤新生血管生成。機體旁分泌大量的血管內皮生長因子(VEGF)刺激局部腫瘤內皮細胞不斷增殖，加速血管生成進程。有研究證實〔2〕，分化抑制因子-1，即DNA結合抑制因子(ID)-1在多種惡性腫瘤中出現高表達，具有促進腫瘤發(fā)展及加速腫瘤血管生成的作用〔3〕。機體中存在的另外一種抑制血管生成的因子是凝血酶敏感蛋白(Tsp)-1，通過抑制機體內皮細胞凋亡，進而抑制內皮細胞的增殖和遷移，從而產生抑制腫瘤血管生成的作用。CD34是一種與血管內皮細胞增殖相關的蛋白，主要通過傳遞內皮細胞間質內信號加速血管生成，常作為腫瘤微血管密度(MVD)標記物。本研究分析皮膚BCC和SCC組織中ID-1、VEGF、Tsp-1及MVD的表達狀況及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2012年2月至2014年5月我院確診的SCC及BCC患者各30例，診斷標準參考文獻〔4〕。患者病理組織標本分別取自面部、頭皮、會陰及四肢等位置。另選取正常皮膚組織樣本24例作為對照組，樣本來源主要是非腫瘤移植皮膚移植者、美容者等。

1.2 藥物試劑 一抗主要是兔抗人ID-1、VEGF、Tsp-1，CD34多克隆抗體、小鼠抗人β-actin多克隆抗體〔5〕；二抗選擇辣根、堿性磷酸酯酶標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠多克隆抗體。主要藥劑選擇甲醛、甘氨酸、Western印跡電泳緩沖液、SDS、轉膜液、Tris-base、洗滌液、封閉液、洗滌液、RIPA蛋白裂解液、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、蛋白Marker、甲苯磺酰氟(PMSF)、5×上樣緩沖液、考馬斯亮藍染色液、麗春紅染液、二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒、定影液和顯色液等。引物序列：ID-1正鏈5'-CAAGTGGCCAGAGGCATGCACTT-3'，負鏈5'-GATGTAGTCTTTACCATCCTGTTG-3'；Tsp-1正鏈5'-AACCGCATTCCAGAGTCTGG-3'，負鏈5'-TTCACCACGTTGTTGTCAAGGGT-3'；VEGF正鏈5'-GAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTC-3'，負鏈5'-CGATCGTTCTGTATCACTCTTTCC-3'。

1.3 免疫組化 所有組織蠟塊樣本處理采用包埋、切片、脫蠟及抗原修復。一抗兔抗人CD34采用磷酸鹽緩沖液(PBS)1∶50條件下稀釋，空白對照選擇PBS代替一抗。二抗是羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HRP)1∶200條件下稀釋，后采用二氨基聯苯胺(DAB)顯色，樹膠封片后備用。ID-1,VEGF,Tsp-1表達陽性標準是胞質、胞膜內存在棕黃色顆粒。MVD水平檢測采用Weidner微血管計數方法，將樣本切片放置于40倍顯微鏡下，隨后確定染色最高血管密度位置，顯微鏡觀察指標轉換為200倍，選擇3個最高血管密度區(qū)計數微血管數目，MVD值即為微血管數目的平均值〔6〕。

1.4 RT-PCR檢測ID-1,Tsp-1和VEGF mRNA在腫瘤組織中的表達情況 選擇新鮮冰凍組織標本為樣本，首先提取總RNA和擴增RT-PCR。95℃預變性10 min；94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，連續(xù)進行30個循環(huán)；再72℃延伸8 min。在瓊脂糖凝膠中將獲得的PCR產物進行電泳、分離，采用紫外分析儀觀察結果并拍攝。采用Lab Works凝膠成像分析系統測定陽性電泳條帶平均灰度值，并計算各樣本基因與β-actin電泳條帶平均灰度值的比值〔7〕。

1.5 Western印跡免疫印跡法檢測ID-1，Tsp-1和VEGF蛋白水平 采用預冷過的PBS洗滌新鮮冰凍組織樣本3次，隨后將其加入裂解液400 μl中，將裂解細胞凍存30 min，4℃ 14 000 r/mim離心5 min，分離得到上清液并測定蛋白質濃度；進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)、轉膜，在室溫下使用含5%胎牛血清(BSA)的Tris鹽酸緩沖液(TBST)封閉1 h，在4℃條件下加入ID-1、VEGF與β-actin抗體(1∶500)，搖床過夜，隨后加二抗，濃度調節(jié)為1∶1 000后進行雜交、洗膜、顯色〔8〕。

1.6 統計學方法 應用SPSS18.0，計量數據多組數據比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK法；計數資料組間比較采用χ2檢驗，指標間的相關性采用Pearson相關分析。

2 結 果

2.1 各組MVD及ID-1、VEGF、Tsp-1陽性表達率比較 三組MVD值及ID-1、VEGF、Tsp-1陽性表達率比較差異顯著(P<0.05)；兩兩比較，SCC組、BCC組與對照組比較均有統計學差異(P<0.05)，SCC組、BCC組間除MVD值存在統計學差異外(P<0.05)，其他指標無統計學差異(P>0.05)。見表1。

2.2 各組 ID-1、VEGF及Tsp-1 mRNA及蛋白表達水平比較 三組ID-1、VEGF及Tsp-1 mRNA及蛋白表達水平比較差異顯著(P<0.05)；相對于對照組，SCC組、BCC組VEGF、ID-1 mRNA及蛋白表達水平明顯提高，Tsp-1水平顯著降低(P<0.05)。SCC組、BCC組比較，ID-1、VEGF、Tsp-1 mRNA及蛋白表達存在統計學差異(P<0.05)。見表2，表3。

表1 各組MVD及ID-1、VEGF、Tsp-1陽性表達率比較

與對照組比較：1)P<0.05；與BCC組比較：2)P<0.05；下表同

表2 各組ID-1、VEGF及Tsp-1 mRNA表達水平比較±s)

表3 各組 ID-1、VEGF及Tsp-1的蛋白表達水平比較

2.3 各指標間相關性分析 Tsp-1表達與ID-1表達、MVD值呈負相關(r=-0.635、-0.736，均P<0.05)，ID-1表達與VEGF水平呈正相關(r=0.748，P<0.05)。

3 討 論

BCC作為臨床常見皮膚科疾病，其發(fā)病機制與基底細胞樣細胞(即生發(fā)細胞)增生有關，表現為圓柱、小葉、條索狀、緞帶狀，屬于惡性皮膚腫瘤〔6〕；多出現在頭面部，臨床病理表現為腫瘤表面結節(jié)、丘疹，伴隨糜爛和潰瘍等，病程進展較慢。SCC主要源自表皮附屬器角質形成細胞，主要在老年人群中多發(fā)，屬于惡性腫瘤，發(fā)病部位多位于頭皮、面部、手背等位置，病因復雜，確診較困難。

ID蛋白屬于螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)反式作用因子，主要包括ID-1、ID-2、ID-3及ID-4，能夠與堿性HLH蛋白(b HLH)產生作用，對蛋白分化轉錄產生抑制作用，從而進行分化抑制，因此又稱作DNA結合抑制因子。相關研究證實〔7〕ID-1蛋白可以通過參與機體內多種信號通路，進而影響人類惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展進程，有潛在癌蛋白屬性，主要能夠將細胞周期阻斷、阻止細胞增殖，有學者稱之為準原癌基因。本次研究結果顯示，ID-1的異常升高與BCC、SCC的發(fā)生有關，與相關研究結論〔8〕相似。

腫瘤內血管生成情況與腫瘤的發(fā)生及轉移、遠期生存率等預后有關，而腫瘤血管生成狀況主要采用MVD作為評估金標準。本次研究結果表明，MVD值與皮膚BCC、SCC的發(fā)生有關，且皮膚SCC存在顯著新血管生成狀況。腫瘤細胞原位生長需要依靠充足營養(yǎng)，可促進腫瘤組織內產生豐富血管組織，而腫瘤血管結構往往并不完全，腫瘤轉移阻力最小，并且與外周血管相連，便于形成淋巴轉移。這同時也是皮膚SCC相對于皮膚BCC，具有惡性度高、侵襲性強及易轉移擴散等特點，導致腫瘤組織血液供應缺乏。

有研究提示〔9〕Tsp-1可以抑制內生性血管生成，其作用機制是加速腫瘤血管成熟，對化療藥物敏感性提高，降低腫瘤內部血管密度，并減少血流量，使腫瘤組織出現明顯萎縮。本研究表明Tsp-1可能與抑制皮膚腫瘤有關，臨床治療方案可以選擇激活Tsp-1，增加其表達水平，從而抑制腫瘤血管生成，最終達到抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。ID-1對皮膚SCC、BCC的發(fā)生發(fā)展具有重要作用，可能與腫瘤血管生成關系密切。ID-1促進血管生成機制〔10〕：ID-1能夠在機體內發(fā)揮雙向調節(jié)作用，ID-1表達水平增加，能夠激活VEGF轉錄，從而促進腫瘤血管生成；反之則抑制VEGF轉錄活性；②ID-1能夠有效抑制Tsp-1轉錄，從而對腫瘤新生血管生成進行有效調控。

綜上所述，皮膚SCC、BCC的發(fā)病與ID-1、VEGF、Tsp-1和MVD密切相關，其中ID-1與VEGF存在協同關系，能夠促進腫瘤組織內血管生成，同時與腫瘤細胞分化程度、MVD值具有相關性。因此，抑制ID-1表達、阻斷VEGF活化，可能對皮膚SCC、BCC發(fā)生發(fā)展起到抑制作用。

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3 董慧婷,張永紅,楊 蕾,等.皮膚鱗狀細胞癌300例臨床及病理回顧分析〔J〕.中國皮膚性病學雜志,2011;25(4):275-7.

4 李軼楠,李東寧.ID-1,VEGF及Tsp-1在皮膚鱗狀細胞癌和基底細胞癌組織中的表達〔J〕.中國皮膚性病學雜志,2013;27(8):767-71.

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10 Luo Y,Zhang X,Tan Z,etal.Astrocyte elevated gene-1 as a novel clinicopathological and prognostic biomarker for gastrointestinal cancers:a meta-analysis with 2999 patients〔J〕.PLoS One,2015;10(12):e0145659.

〔2015-12-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

閆鐵夫(1972-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事皮膚與性病方面的研究。

R73

A

1005-9202(2016)20-5051-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.052