劉 丹 張 偉 孫洪英 董向力 王貴喜 賈 璐 李新輝 張 佳 楊 靜

(包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

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·心、腦血管及代謝性疾病·

腫瘤壞死因子-α基因多態(tài)性及其血清水平與腦梗死的相關(guān)性

劉 丹 張 偉 孫洪英 董向力 王貴喜 賈 璐 李新輝 張 佳 楊 靜

(包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

目的 探討腫瘤壞死因子(TNF)-α T1031C多態(tài)性位點(diǎn)及血清水平與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的病情嚴(yán)重程度和發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。方法 選擇動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者(病例組)120例，健康者75例為對(duì)照組。采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)，檢測(cè)兩組TNF-α T1031C多態(tài)的分布。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELLSA)檢測(cè)兩組患者血清TNF-α水平。結(jié)果 病例組TNF-α T1031C的CC基因型、C等位基因頻率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。TNF-α T1031C的各基因型與腦梗死病情嚴(yán)重程度無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。Logistic回歸校正性別、年齡、吸煙、血糖、血壓等因素后，TNF-α T1031C的CC基因型腦梗死發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯增加(OR=3.671，95%CI：10.26～13.135，P=0.046)。病例組TNF-α血清水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。病例組和對(duì)照組TNF-α T1031C各基因型的血清TNF-α水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。結(jié)論 TNF-α基因 T1031C的CC基因型增加動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，C等位基因是腦梗死的遺傳易感基因之一。

腫瘤壞死因子α；基因多態(tài)性；腦梗死；遺傳易感性

動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的病因復(fù)雜，遺傳和環(huán)境因素在其發(fā)病過(guò)程中起重要的作用，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，但目前認(rèn)為腦缺血缺氧造成的能量代謝障礙、興奮性神經(jīng)介質(zhì)釋放、鈣過(guò)量?jī)?nèi)流、自由基反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、炎癥免疫反應(yīng)等一系列缺血性連鎖反應(yīng)是導(dǎo)致缺血性腦損害的中心環(huán)節(jié)〔1〕。腫瘤細(xì)胞壞死因子(TNF)-α作為最重要的免疫和炎癥相關(guān)因子之一，廣泛參與體內(nèi)各種炎癥和免疫應(yīng)答過(guò)程。研究表明，血清TNF-α水平在腦梗死急性期增高，與腦梗死的發(fā)病、發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔2～5〕。TNF-α基因多處位點(diǎn)存在多態(tài)性，有報(bào)道其基因多態(tài)性與冠心病、腦梗死等動(dòng)脈粥樣硬化性疾病和免疫疾病密切相關(guān)〔6～11〕，但TNF-α 基因T1031C多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。本文研究探討TNF-α基因T1031C多態(tài)性、血清TNF-α水平與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的病情嚴(yán)重程度和發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2012年9月至2013年6月在我科連續(xù)住院的初發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死(發(fā)病1 w之內(nèi))患者(病例組)120例，男73例，女47例，平均年齡(62.43±11.72)歲，不包括腔隙性腦梗死和腦栓塞患者，均符合全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議通過(guò)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭顱CT或MRI檢查證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重感染、惡性腫瘤、結(jié)締組織病以及1年內(nèi)患組織損傷疾病如心肌梗死，重大外科手術(shù)及接受免疫抑制劑治療者除外。同期選擇健康體檢者為對(duì)照組75例，男45例，女30例，平均年齡(61.69±9.68)歲。兩組年齡(t=0.453，P=0.651)、性別(χ2=0.013,P=0.908)相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有入組者均知情同意，均為包頭市長(zhǎng)住居民、漢族、彼此無(wú)親緣關(guān)系。

1.2 方法

1.2.1 血液標(biāo)本收集與測(cè)定 病例組患者在入院第2天清晨06：00空腹采集靜脈血4 ml和2 ml各1管，4 ml管離心后取血清，放于-30℃低溫冰箱中保存待測(cè)TNF-α血清濃度，2 ml管置EDTA-Na2抗凝管中-30℃冰箱保存檢測(cè)基因多態(tài)性。TNF-α血清水平檢測(cè)方法采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，試劑盒是美國(guó)R&D公司分裝。操作過(guò)程按試劑盒說(shuō)明。TNF-α基因 T1031C多態(tài)性采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測(cè)。對(duì)照組在體檢當(dāng)天亦空腹采血，保存和檢測(cè)方法同上。

1.2.2 病例登記 對(duì)病例組患者和對(duì)照組進(jìn)行登記。登記內(nèi)容包括：①患者的一般資料(包括姓名、性別、年齡、職業(yè)、民族、住院號(hào)、地址、聯(lián)系電話等)；②既往情況(既往病史及健康狀況、吸煙飲酒史)；③住院情況〔包括入院日期、入院美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損評(píng)分(NIHSS)評(píng)分、實(shí)驗(yàn)室血液學(xué)檢驗(yàn)值、頸部血管超聲、頭顱影像結(jié)果、出院日期、并發(fā)癥等〕。

1.3 基因型判定 采用PCR檢測(cè)，PCR引物序列參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，由上海生工合成。TNF-α T1031C基因擴(kuò)增引物序列為：上游引物：5'-TATGTGATGGACTCACCAGGT-3'，下游引物：5'-CCTCTACATGGCCCTGTCTT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為264 bp。反應(yīng)體系為25 μl，其中模板DNA模板5 μl，PremixEx Taq DNA 聚合酶12.5(含Buffer，dNTP，MgCl2)，上游及下游引物各1 μl(10 pmol/L)，加無(wú)菌蒸餾水至25 μl。循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物分別經(jīng)BbsⅠ限制性內(nèi)切酶37℃水浴2 h后，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后分析基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件行方差分析及χ2檢驗(yàn)，采用Logistic回歸分析基因型與腦卒中的發(fā)病關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料、生化指標(biāo)及血清TNF-α水平比較 與對(duì)照組比較，病例組吸煙者比例、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血小板水平、血清TNF-α水平增高(P<0.05)，總膽固醇(TC)水平雖增高，但差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較±s)

2.2 兩組TNF-α基因型鑒定 兩組TNF-α T1031C基因型，分別為TT、TC、CC型，均以TT型為主，CC型最少。TNF-α T1031C的CC基因型(純和突變型)為195 bp和69 bp兩條片段，TC基因型(雜合型)為264 bp，195 bp和69 bp 3條片段，TT基因型(野生型)為440 bp 1條片段(圖1)。

M:50 bp DNA ladder；1、2、3、5、7、8：TT型；4、6：TC型；10：CC型圖1 PCR-BbsⅠ酶切的TNF-α 1031SNP基因型分型

2.3 兩組TNF-α T1031C基因型和等位基因頻數(shù)分布比較 兩組人群TNF-α T1031C多態(tài)性基因型分布均處于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，具有群體代表性。與對(duì)照組比較，病例組CC基因型和C等位基因頻率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 病例組與對(duì)照組TNF-α T1031C基因型和等位基因頻率〔n(%)〕

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

2.4 TNF-α T1031C基因型與腦梗死病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性 病例組根據(jù)NIHSS標(biāo)準(zhǔn)在入院第1天進(jìn)行評(píng)分，分為輕型組(<4分)71例，中型組(4～10分)27例，重型組(>10分)22例。未發(fā)現(xiàn)TNF-α T1031C基因型與腦梗死病情嚴(yán)重程度存在相關(guān)性(χ2=7.486,P=0.112)，見(jiàn)表3。

表3 TNF-α T1031C基因型與腦梗死病情嚴(yán)重程度相關(guān)性〔n(%)〕

2.5 TNF-α T1031C不同基因型與腦梗死發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 以腦梗死是否發(fā)生為因變量，以年齡、性別、吸煙史、FPG、DBP、SBP、TC、TG、LDL-C、HDL-C和TNF-α T1031C基因型為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析結(jié)果表明，TNF-α T1031C的CC基因型(OR=3.671，95%CI：10.26～13.135，P=0.046)、TC水平、LDL-C、FPG、SBP、TG顯著增加腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05)，是腦梗死發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

2.6 TNF-α T1031C基因型與TNF-α血清水平的相關(guān)性 兩組TNF-α T1031C各基因型的血清TNF-α水平無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 不同TNF-α基因型患者TNF-α血清水平

3 討 論

TNF-α是一種重要的具有廣泛生物學(xué)功能的多肽類細(xì)胞因子，主要是由激活的單核C巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子〔12〕，TNF-α在活化的巨噬細(xì)胞內(nèi)以膜結(jié)合型存在，并多以旁分泌或自分泌釋放。在正常情況下，它具有抗腫瘤、抗感染和促進(jìn)組織修復(fù)等作用，對(duì)機(jī)體有利。若持續(xù)釋放，則會(huì)引起機(jī)體發(fā)熱、休克、惡病質(zhì)和組織損傷。因此它不僅是一種重要的免疫細(xì)胞因子，又是一種重要的炎性細(xì)胞因子〔13〕。近年研究表明，TNF-α與腦梗死、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、免疫相關(guān)等疾病密切相關(guān)〔2～5〕，參與了這些疾病的發(fā)生發(fā)展。

人類TNF-α基因定位于人染色體6p21.1-p21.3，位于MHC Ⅲ類基因區(qū)內(nèi)。TNF-α基因具有多態(tài)性，其多態(tài)性位點(diǎn)主要集中在其啟動(dòng)子區(qū)域的：-1031、-244、-308、-376、-49、-419、-163、-238、-857、-863等位點(diǎn)。目前關(guān)于其-308、-238 位點(diǎn)的多態(tài)性與疾病的研究較多，有報(bào)道TNF-α G308A及TNF-α G238A 多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化、腦梗死、冠心病的發(fā)生有關(guān)聯(lián)〔6～9，14〕。

本研究結(jié)果提示，TNF-α基因T1031C多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的遺傳易感性相關(guān)，C等位基因是動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的遺傳易感基因之一。推測(cè)，TNF-α基因的1031位點(diǎn)的堿基T被堿基C所替代，可能影響TNF-α的表達(dá)，從而促進(jìn)腦梗死的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)本研究首次對(duì)TNF-α基因 T1031C多態(tài)性與腦梗死病情嚴(yán)重程度進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，TNF-α基因 T1031C多態(tài)性與腦梗死病情嚴(yán)重程度無(wú)相關(guān)性，也提示TNF-α基因 T1031C多態(tài)性可能對(duì)于內(nèi)蒙古地區(qū)漢族人群的腦梗死病變程度沒(méi)有影響。

本研究結(jié)果與曹紅元等〔2～4〕研究結(jié)果一致，表明不論是病例組還是對(duì)照組，TNF-α T1031C各基因型的血清TNF-α水平無(wú)顯著差異，這說(shuō)明二者之間無(wú)相關(guān)性。

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〔2015-03-09修回〕

(編輯 安冉冉/曹夢(mèng)園)

內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究一般項(xiàng)目(No.NJZY13245)；包頭市社會(huì)發(fā)展科技支撐項(xiàng)目(2012S2006-04-08)

劉 丹(1973-)，女，碩士，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦血管病基礎(chǔ)與臨床研究。

R743.3

A

1005-9202(2016)20-5002-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.026