王 穎 洪銘巖 周秀敏

(唐山市工人醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 唐山 063000)

?

異甘草素對(duì)人卵巢漿液性乳頭狀腺癌細(xì)胞株SKOV3體外增殖的抑制和誘導(dǎo)自噬作用

王 穎 洪銘巖1周秀敏

(唐山市工人醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 唐山 063000)

目的 探討異甘草素(ISL)對(duì)人卵巢漿液性乳頭狀腺癌細(xì)胞株SKOV3體外增殖的抑制作用。方法 從30例卵巢漿液性乳頭狀腺癌患者中提取SKOV3細(xì)胞株，采用MTT比色法觀察分析ISL對(duì)SKOV3細(xì)胞株體外增殖的抑制作用；應(yīng)用Western印跡檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3的表達(dá)水平。結(jié)果 ISL能夠有效抑制SKOV3細(xì)胞株的體外增殖，與藥物使用時(shí)間、劑量呈正比；ISL對(duì)SKOV3細(xì)胞株作用48 h后，ISL劑量5、10 μg/ml的兩組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。細(xì)胞核進(jìn)行熒光染色后，出現(xiàn)變圓、破碎以及染色質(zhì)濃縮的現(xiàn)象。結(jié)論 ISL對(duì)人卵巢漿液性乳頭狀腺癌細(xì)胞株SKOV3體外增殖有明顯的抑制與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬的作用，是一種有效的治療檢測(cè)方法。

異甘草素；卵巢漿液性乳頭狀腺癌；SKOV3細(xì)胞株

異甘草素(ISL)是一種黃酮類化合物，是甘草中一種非常重要的活性成分，能夠起到抗腫瘤、抗病毒以及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化等作用。ISL對(duì)多種腫瘤細(xì)胞都有明顯的體外抑制作用〔1〕，本文重點(diǎn)分析ISL對(duì)人卵巢漿液性乳頭狀腺癌細(xì)胞株SKOV3體外增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究經(jīng)唐山市工人醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試患者均簽署知情同意書。SKOV3細(xì)胞株從臨床30例卵巢漿液性乳頭狀腺癌患者身上提取。ISL由天津馬克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)(批號(hào)為GC 2012203)；胎牛血清由杭州四季青公司生產(chǎn)；DMSO、MTT從Sigma實(shí)驗(yàn)所購(gòu)買，兔抗人Beclin1抗體和兔抗人LC3抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 檢測(cè)方法 將含量10%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100 μg/ml鏈霉素培養(yǎng)液在37℃、含量5%的二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于研究。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，將其加入到96孔板中，采用1×10個(gè)/孔方式，等待細(xì)胞過(guò)夜并且貼到孔板壁上時(shí)，試驗(yàn)組加入不同的濃度的ISL，濃度分別是5、10 μg/ml，對(duì)照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)液。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，37℃、5%的二氧化碳飽和濕度條件下培養(yǎng)6、12、24、48 h后，再在每個(gè)孔中加入濃度為5 mg/ml的20 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，丟掉上層液，再在每個(gè)孔中加入150 μl的DMSO，然后振蕩3 min，溶解結(jié)晶，490 nm處用酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度A值，細(xì)胞抑制率=(1-試驗(yàn)組A值/空白對(duì)照組A值)×100%，重復(fù)三次，取三次的平均值。觀察ISL不同濃度下作用48 h后的SKOV3細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，采用熒光染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并且拍照。吖啶橙/溴乙啶雙熒光染色后觀察細(xì)胞形態(tài)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種于6孔板，24 h細(xì)胞貼壁后換液，加入不同濃度的ISL，使其終濃度為0、5、10 μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄上清液，PBS清洗3遍，RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞提取蛋白，蛋白質(zhì)定量試劑盒BCA法蛋白定量、變性，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。轉(zhuǎn)膜成功后，50 g/L脫脂奶封閉2 h，分別加入一抗GAPDH、Beclin1、LC3(1∶1 000稀釋)，4℃條件下孵育過(guò)夜，洗膜，二抗孵育1 h，洗膜，滴加ECL超敏化學(xué)發(fā)光劑，暗盒曝光顯影，采用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 ISL對(duì)人SKOV3細(xì)胞株體外增殖的抑制作用 5、10 μg/ml的ISL對(duì)人SKOV3細(xì)胞株體外增殖有明顯的抑制作用，并且隨著藥物濃度的增加與培養(yǎng)時(shí)間增加，抑制作用更加明顯，抑制作用明顯好于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察 試驗(yàn)組采用不同濃度的ISL作用6、12、24、48 h后，光鏡下細(xì)胞出現(xiàn)皺縮變圓、體積也隨之縮??；細(xì)胞質(zhì)中能夠看到比較多的顆粒與空泡，胞核不清晰，有片狀無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)。對(duì)照組的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)、幾乎沒(méi)有脫落的，細(xì)胞形態(tài)比較完整，細(xì)胞質(zhì)比較飽滿清晰，鄰近的細(xì)胞能夠生長(zhǎng)并融合成片狀，能夠看到核分裂現(xiàn)象，見(jiàn)圖1。

表1 ISL對(duì)人SKOV3細(xì)胞株體外增殖的抑制率

與ISL 0 μg/ml組比較:1)P<0.05

2.3 Western印跡檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3的表達(dá) ISL處理細(xì)胞后，隨著濃度的增加，Beclin1、LC3蛋白表達(dá)增加。ISL 5、10 μg/ml組與0 μg/ml組比較差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖1 吖啶橙/溴乙啶雙染后觀察SKOV3細(xì)胞的形態(tài)改變(×200)

圖2 ISL作用于SKOV3細(xì)胞株后 LC3和Beclin1的蛋白水平變化

3 討 論

卵巢癌是一種女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，也沒(méi)有可靠的篩選方法，導(dǎo)致大多數(shù)患者就診時(shí)都已經(jīng)到了晚期，治愈成功率非常低〔2〕。目前卵巢癌常用治療方法是外科手術(shù)，并輔以鉑類藥物進(jìn)行化療，但是鉑類藥物會(huì)產(chǎn)生較大的不良反應(yīng)，長(zhǎng)時(shí)間使用將會(huì)產(chǎn)生耐藥性〔3〕，從而導(dǎo)致治療失敗，患者的生存率非常低〔4〕。本實(shí)驗(yàn)采用的ISL在治療這種疾病方面具有較好療效，且具有不良反應(yīng)小、不容易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)〔5〕。本研究也證實(shí)，ISL對(duì)人卵巢漿液性乳頭狀腺癌SKOV3細(xì)胞株體外增殖有明顯的抑制作用，并且存在量效與時(shí)效的正比例關(guān)系。ISL還能夠增加SKOV3細(xì)胞自噬發(fā)生率，自噬水平隨著藥物濃度升高而升高，細(xì)胞形態(tài)也會(huì)發(fā)生變化〔6，7〕。

綜上所述，ISL對(duì)人SKOV3細(xì)胞株體外增殖有明顯的抑制與誘導(dǎo)自噬作用，目前只是證明其是一種有效的治療檢測(cè)手段，期待在進(jìn)一步研究中出現(xiàn)更有意義的發(fā)現(xiàn)。

1 張棟棟，付亞杰，陳小蕓，等.異甘草素誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3凋亡及自噬的研究〔J〕.重慶醫(yī)學(xué)，2015；44(3)：315-7.

2 Kim JR，Kim BM，Kim YM，etal..Colonic metastasis presenting as an intraluminal fungating mass 8 years after surgery for ovarian cancer〔J〕.Ann Coloproctol，2015；31(5)：198-201.

3 Weng Z，Gao H，Hu J，etal.Isoalantolactone induces autophagic cell death in SKOV3 human ovarian carcinoma cells via upregulation of PEA-15〔J〕.Oncol Rep，2016；35(2)：833-40.

4 宋文爽，葉 元.Vandetanib對(duì)人卵巢癌細(xì)胞抑制作用機(jī)制探討〔J〕.中華腫瘤防治雜志，2014；21(20)：1589-93.

5 劉 俊，蔡云朗，任慕蘭，等.PI-103對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株 SKOV3/DDP順鉑化療效果的影響〔J〕.東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2013；32(5)：574-9.

6 Choi CH，Sung CO，Kim HJ，etal.Overexpression of annexin A4 is associated with chemoresistance in papillary serous adenocarcinoma of the ovary〔J〕.Human Pathol，2013；44(6)：1017-23.

7 Yuan X，Yu B，Wang Y，etal.Involvement of endoplasmic reticulum stress in isoliquiritigenin-induced SKOV-3 cell apoptosis〔J〕.Recent Pat Anticancer Drug Discov，2013；8(2)：191-9.

〔2015-12-15修回〕

(編輯 李相軍)

洪銘巖(1978-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事外科腫瘤方面的研究。

王 穎(1977-)，女，主治醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科腫瘤方面的研究。

R737.3

A

1005-9202(2016)20-5000-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.025

1 唐山市工人醫(yī)院外科