王志濤 杜珍武 張桂珍 王亞軍

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院骨科，吉林 長春 130041)

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CD44s、CD44v6、CD44v9在骨肉瘤、骨巨細胞瘤及骨軟骨瘤標(biāo)本的表達及臨床意義

王志濤 杜珍武 張桂珍 王亞軍

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院骨科，吉林 長春 130041)

目的 探究變異體CD44s、CD44v6及CD44v9與骨肉瘤分化、轉(zhuǎn)移及惡性程度的關(guān)系。方法 通過qPCR技術(shù)檢測10例骨肉瘤、8例骨巨細胞瘤、5例骨軟骨瘤標(biāo)本中變異體CD44s、CD44v6及CD44v9的表達水平，應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法進行數(shù)據(jù)處理，同時結(jié)合患者臨床資料和病理資料進行相關(guān)性分析。結(jié)果 (1)CD44s、CD44v6在骨肉瘤和骨巨細胞瘤中的表達明顯高于骨軟骨瘤(均P<0.05)，但在骨肉瘤和骨巨細胞瘤之間的表達無顯著差異(均P>0.05)。(2)CD44v9在骨軟骨瘤中無表達，在骨肉瘤和骨巨細胞瘤之間的表達無顯著差異(P>0.05)。(2)CD44v9在低分化骨肉瘤表達高于高分化骨肉瘤(P<0.05)，在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤表達高于非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤(P<0.05)，而CD44s和CD44v6與骨肉瘤分化和轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論 CD44s、CD44v6及CD44v9在不同骨腫瘤之間表達有差異。CD44s、CD44v6及CD44v9三者當(dāng)中只有CD44v9的表達與骨肉瘤的分化和轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，并且分化和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。CD44v9可作為判斷骨肉瘤惡性程度的一個指標(biāo)。

骨肉瘤；CD44s；CD44v6；CD44v9

骨肉瘤在所有原發(fā)于骨組織的惡性腫瘤中所占比例最高〔1〕，盡管手術(shù)加化療已使非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者5年生存率由20%提升到60%〔2，3〕，但骨肉瘤極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，大約20%的患者在骨肉瘤確診時已經(jīng)出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移灶，另外80%的患者在手術(shù)治療后發(fā)生了轉(zhuǎn)移〔4，5〕。這些伴有轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者，其5年生存率仍舊為20%〔6〕。CD44在骨肉瘤浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用〔7〕。CD44屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白家族，負責(zé)調(diào)控細胞與細胞及ECM間的相互作用〔8〕。CD44基因經(jīng)選擇性剪切和轉(zhuǎn)錄后修飾形成了多種CD44v，它們是CD44參與調(diào)控淋巴細胞激活、再循環(huán)及歸巢、炎癥反應(yīng)和腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能的基礎(chǔ)〔9〕，其中CD44s、v6和v9的反常表達與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切〔10～13〕。本實驗擬探討變異體CD44s、CD44v6及CD44v9與骨肉瘤分化、轉(zhuǎn)移及惡性程度的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 對象 收集吉林大學(xué)第二醫(yī)院2009年4月至2013年1月的骨腫瘤病理切片，由兩名病理科醫(yī)生獨立診斷，同時結(jié)合臨床資料確定腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。共收集到23例患者，其中骨肉瘤10例，男7例，女3例；年齡12～87歲，低分化6例、高分化4例，發(fā)生轉(zhuǎn)移6例、無轉(zhuǎn)移4例；骨巨細胞瘤8例，男女各4例，年齡26～54歲；骨軟骨瘤5例，男3例，女2例；年齡9～73歲。患者臨床資料完整，且術(shù)前未進行放、化療。

1.2 主要試劑 Trizol購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒“PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA ynthesis Kit”購自Takara公司，瓊脂糖購自BIOWEST公司，TAE電泳液(50×)購自天恩澤公司，qPCR試劑盒“All-in-OneTMqPCR Mix”購自GeneCopoeia公司，定量PCR反應(yīng)板購自BIOPLASTICS公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成 CD44s、CD44v6及CD44v9引物序列參考文獻〔14〕，序列：CD44s上游引物5′-GGAGCAGCACTTCAGGAGGTTAC-3′，下游引物5′-GGAATGTGTCTTGGTCTCTGGTAGC-3′；CD44v6上游引物5′-CCAGGCAACTCCTAGTAGTACAACG-3′，下游引物5′-CGAATGGGAGTCTTCTTTGGGT-3′；CD44v9上游引物5′-AGCAGAGTAATTCTCAGAGC-3′，下游引物5′-TGATGTCAGAGTAGAAGTTGTT-3′；β-actin上游引物5′-GTGAAGGTGACAGCAGTCGGTT-3′，下游引物5′-GAAGTGGGGTGGCTTTTAGGAT-3′。引物由上海賽百盛公司合成。

1.3.2 標(biāo)本組織切片RNA提取 標(biāo)本組織RNA提取方法參照文獻〔15〕。主要步驟：①取切片3張，浸于二甲苯5 min，無水乙醇洗滌兩遍，自然晾干；②在切片上滴加組織裂解緩沖液(20 mmol/L Tris，pH8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；2% SDS，pH7.2)，將切片上組織刮入1.5 ml離心管內(nèi)，加組織裂解緩沖液250 μl混勻，加入蛋白酶K(終濃度400 mg/L)，置于58℃消化至液體清亮，消化后的組織置于 95℃10 min。③加Trizol 1 ml，按Trizol試劑說明書進行RNA 提取。將提取到的RNA進行含量、純度及完整性檢測，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 標(biāo)本RNA逆轉(zhuǎn)錄 取標(biāo)本RNA 3 μl，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將各標(biāo)本RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 實時熒光定量PCR 每孔反應(yīng)體系共計20 μl，包括標(biāo)本cDNA 1 μl，“2×All-in-one qPCR Mix”10 μl，上下游引物各0.5 μl，“50×RoxReference Dye”0.4 μl，去RNase水7.6 μl。反應(yīng)條件為95℃ 3 min初變性，然后95℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 30 s，共計40個循環(huán)，隨后72℃延伸3 min。應(yīng)用IDEAS軟件計算出CT值，應(yīng)用2-△△CT方法計算各基因在標(biāo)本中表達的相對定量。

1.4 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS19軟件行方差分析和獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 CD44s在各組標(biāo)本中的表達 CD44s在骨肉瘤組和骨巨細胞瘤組的相對表達量高于骨軟骨瘤組(P<0.05)，而在骨肉瘤組和骨巨細胞瘤組表達無顯著差異(P>0.05)。

2.2 CD44v6在各組標(biāo)本中的表達 CD44v6在骨肉瘤組和骨巨細胞瘤組表達量高于骨軟骨瘤組(均P<0.05)，而在骨肉瘤組和骨巨細胞瘤組無顯著差異(P>0.05)。

2.3 CD44v9在各組標(biāo)本中的表達 CD44v9在骨軟骨瘤組無表達，而在骨肉瘤組和骨巨細胞瘤組的表達量無顯著差異(P>0.05)。

2.4 CD44s、CD44v6和CD44v9的表達與骨肉瘤分化的相關(guān)性 CD44v9在低分化骨肉瘤表達的相對定量高于高分化骨肉瘤(P<0.05)，而CD44s、CD44v6無類似相關(guān)性，見表1。

2.5 CD44s、CD44v6和CD44v9在骨肉瘤標(biāo)本中的表達與轉(zhuǎn)移的相關(guān)性 CD44v9在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤表達量高于非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤(P<0.05)，而CD44s、CD44v6無類似相關(guān)性，見表2。

表1 CD44s、CD44v6和CD44v9在骨肉瘤低分化組和高分化組的表達±s)

與低分化組相比：1)P<0.05

表2 CD44s、CD44v6和CD44v9在骨肉瘤轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組的表達±s)

與轉(zhuǎn)移組比較：1)P<0.05

3 討 論

CD44s是CD44變異體標(biāo)準型。彭挺生等〔16〕的研究表明相比骨纖維結(jié)構(gòu)不良標(biāo)本，CD44s在骨肉瘤中的表達水平顯著升高，CD44s的表達與骨肉瘤的分化呈負相關(guān)，并且其表達水平越高越容易出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移。筆者同樣分析了CD44s表達與骨肉瘤分化和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，但未發(fā)現(xiàn)類似相關(guān)性。Kim等〔17〕應(yīng)用免疫組化檢測50例骨肉瘤標(biāo)本中CD44s、CD44v5、CD44v6的表達水平，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)CD44s的表達與分化和轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)性，與本的研究結(jié)果相似。

CD44v6是研究較早的一種CD44v。陳雷等〔18〕應(yīng)用免疫組化研究結(jié)果證實，相較骨軟骨瘤及正常骨組織，CD44v6 在骨肉瘤中的表達顯著升高，但與預(yù)后無顯著相關(guān)性，CD44v6可作為判斷骨肉瘤惡性程度的指標(biāo)。林建華等〔19〕采用免疫組化實驗，結(jié)果表明相較骨軟骨瘤和正常骨組織，MMP-9及CD44v6在骨肉瘤的表達水平明顯升高，兩者表達呈正相關(guān)，作者認為通過聯(lián)合檢測患者病理標(biāo)本中MMP-9及CD44v6的表達可以判斷骨肉瘤的惡性程度。辛榕等〔20〕研究表明相比骨軟骨瘤，CD44、CD44v3和v6在骨肉瘤的表達顯著升高，并且CD44v6的表達水平最高，CD44V6可以作為診斷骨腫瘤惡性表型的標(biāo)志。筆者實驗同樣證實相比骨軟骨瘤，CD44v6在骨肉瘤和骨巨細胞瘤的表達水平顯著升高，但未發(fā)現(xiàn)CD44v6的表達與骨肉瘤分化和轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)性，因此CD44v6不能作為骨肉瘤惡性程度的標(biāo)志。

有關(guān)CD44v9與骨肉瘤關(guān)系的研究較少。高文〔21〕采用免疫組化發(fā)現(xiàn)CD44v9在骨肉瘤的表達水平高于另外兩者，并且在骨軟骨瘤中陽性表達率為0。本實驗同樣證實CD44v9在骨肉瘤的表達高于骨軟骨瘤且CD44v9在骨軟骨瘤中無表達，但未能證明CD44v9在骨肉瘤的表達高于骨巨細胞瘤。另外筆者發(fā)現(xiàn)CD44v9的表達與骨肉瘤分化和轉(zhuǎn)移有關(guān)張翠萍等〔22〕應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測CD44v9在結(jié)直腸癌組織中的表達，發(fā)現(xiàn)CD44v9與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移性有關(guān)。李志高等〔23〕應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)CD44v9的表達與大腸癌分化和轉(zhuǎn)移有關(guān)：CD44v9表達隨大腸癌分化程度降低而升高，在伴有轉(zhuǎn)移的大腸癌中表達高于非轉(zhuǎn)移大腸癌中的表達。以上兩次研究均證實CD44v9可以成為判斷腫瘤惡性程度的重要生物學(xué)標(biāo)志，與本實驗結(jié)論相似。

綜上所述，CD44s、CD44v6及CD44v9在不同骨腫瘤之間表達有差異。CD44s、CD44v6及CD44v9三者當(dāng)中只有CD44v9的表達與骨肉瘤的分化和轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，并且分化和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。CD44v9可作為判斷骨肉瘤惡性程度的一個指標(biāo)。

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〔2016-07-20修回〕

(編輯 曲 莉)

王亞軍(1960-)，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事骨與關(guān)節(jié)、 四肢創(chuàng)傷臨床研究。

王志濤(1989-)，男，在讀碩士，主要從事骨與關(guān)節(jié)、 四肢創(chuàng)傷臨床研究。

R68

A

1005-9202(2016)20-4998-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.024