席 晅 任小瓊

(甘肅醫(yī)學院基礎教學部生理學教研室，甘肅 平涼 744000)

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天麻素注射液對帕金森病大鼠的保護作用

席 晅 任小瓊1

(甘肅醫(yī)學院基礎教學部生理學教研室，甘肅 平涼 744000)

目的 觀察天麻素注射液對帕金森病(PD)大鼠的保護效應及探討其部分機制。方法 將60只大鼠隨機分為假手術組、天麻組及模型組，各20只。其中天麻組及模型組接受紋狀體內多位點注射6-羥基多巴胺(OHDA)以建立PD模型，造模成功后模型組接受0.2 g·kg-1·d-1生理鹽水肌肉注射，天麻組接受0.2 g·kg-1·d-1天麻素注射液肌肉注射，持續(xù)干預14 d直至處死。比較各組干預前后行為學變化，紋狀體組織中 Bcl-2、Bax 蛋白及mRNA的表達變化。結果 ①接受PD模型造模后的大鼠旋轉次數(shù)明顯較假手術組增多(P<0.05)，經過天麻素注射液治療后大鼠旋轉次數(shù)明顯減少(P<0.05)。②接受造模的大鼠紋狀體內Bcl-2蛋白/mRNA水平低于假手術組，Bax蛋白/mRNA水平顯著高于假手術組(P<0.01)，經過干預后天麻素組紋狀體內Bcl-2蛋白/mRNA水平較模型組明顯升高(P<0.05)，Bax蛋白/mRNA水平明顯下降(P<0.05)。結論 天麻素可明顯改善PD模型大鼠的臨床癥狀，其機制可能與通過升高紋狀體Bcl-2降低Bax含量有關。

帕金森??；天麻素注射液；Bcl-2；Bax

帕金森病(PD)發(fā)病原因目前尚未有統(tǒng)一的定論，以靜止性震顫、肌肉強直、運動遲緩為主要臨床表現(xiàn)，以黑質紋狀體多巴胺(DA)神經元漸進性數(shù)量減少或者變性為病理改變〔1〕。目前針對PD的發(fā)病機制有學者提出“凋亡”假說，他們認為PD疾病發(fā)展的最終階段均表現(xiàn)為DA能神經元細胞的凋亡〔2〕。Bcl-2及Bax兩個因子廣泛參與調控神經元細胞的凋亡過程。目前治療方法雖可以發(fā)揮一定的治療作用，但仍無法阻止DA神經系統(tǒng)的進一步紊亂?，F(xiàn)代藥理學研究證實天麻素具有清除自由基、保護神經元等作用，日本早已將天麻素運用于各類肢體震顫的治療中。本研究通過檢測PD大鼠紋狀體Bcl-2及Bax因子的表達變化，以探討天麻素治療PD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性健康成年 SD大鼠，清潔級，60只，平均體質量(275±25)g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司(許可證號碼：SCXX(滬)2007-0005)。SPF級醫(yī)學實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，溫度(22±2)℃，相對濕度(60±10)%，定時通風換氣，模擬標準晝夜系統(tǒng)即12 h光照+12 h黑夜，可提供實驗動物在該恒溫恒濕環(huán)境中適應性喂養(yǎng)1 w，給予自由飲食和飲水。隨機分為假手術組、天麻組和模型組各20只。

1.2 主要試劑及儀器 Bc1-2、Bax、β-actin 一抗、堿性磷酸酶標記山羊抗兔(CST 公司，美國)；預染蛋白彩虹 Marker(Promega 公司，美國)；Trizol(Invitrogen 公司，美國)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)免疫組化試劑盒(ZYMH 公司，美國)，PCR 引物(生工生物工程有限公司，上海)，大鼠顱鉆(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，6-羥基多巴(美國Sigma 公司產品)。

1.3 模型制備 室溫 22℃ 條件下，大鼠稱重后，以 3 ml/kg腹腔注射10%水合氯醛進行完全麻醉后固定于腦立體定位儀上，前囟部位充分消毒后備皮，根據《大鼠腦立體定位圖譜》確定左側紋狀體坐標，以微量進樣器頭分別于兩個注射點進行6-OHDA溶液注射：①正中線左旁開3 mm，于前囟平行處，硬膜下5.5 mm；②正中線左旁開3 mm，于前囟嘴側0.7 mm，硬膜下4.5 mm。藥物劑量3 μg/μl，注射速度1 μl/min。注射完畢后緩慢退出微量進樣器針頭，縫合皮膚，碘伏局部消毒。造模成功后模型組接受0.2 g·kg-1·d-1生理鹽水肌肉注射，天麻組接受0.2 g·kg-1·d-1麻素注射液肌肉注射。比較各組干預前后行為學變化，紋狀體組織中Bcl-2、Bax蛋白及mRNA的表達變化。假手術組用等量生理鹽水替代6-OHDA，操作方法同上。

1.4 Western印跡法檢測相關因子蛋白的表達 取各組紋狀體組織50 mg 剪碎，用勻漿器勻漿后置于冰上，加入 0.25 ml 含蛋白酶抑制劑(PMSF)裂解緩沖液后再進行研磨至完全裂解后充分混勻，14 000 r/min，4℃，離心5 min，取上清液100 μl，EP 管分裝后備用。將樣本依次逐漸上樣至事先將配制好的 SDS-PAGE 膠中，先用 80 V的電壓跑濃縮膠，當樣品跑至分離膠時則改用100 V電壓，待溴酸藍跑至膠底部即可停止電泳，再經過轉膜、封閉孵育后分別加入按照1∶1 000稀釋的Bc1-2、Bax一抗。4℃ 搖床孵育過夜后以洗滌緩沖液(TBST)漂洗3次，每次10 min。再按說明書加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗，放入聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫，搖床孵育2 h。二抗孵育完成后，將PVDF膜取出用TBST清洗3次，每次10 min，最后再將用TBST浸洗15 min。將PVDF取出，用濾紙吸去液體，置于平鋪保鮮膜的工作臺上，加入電化學發(fā)光(ECL)試劑(A液與B液等體積混合)，放入暗室中，靜置反應1 min。運行Bio-Rad Image軟件生物圖像分析處理。

1.5 RT-PCR技術檢測相關因子mRNA的表達 將各組紋狀體組織50 mg移至1.5 ml EP管中加入0.25 ml Trizol研磨，再加入300 ml Trizol吹打均勻，加入0.2 ml氯仿，將管蓋閉合后劇烈震蕩15 s后室溫靜置3 min。在低溫離心機上4℃，轉速12 000 r/min，離心15 min，輕輕將上層水相移至新EP管中，用焦碳酸二乙酯(DEPC)水30 μl溶解RNA，根據RNA濃度計算上樣量，逆轉錄成cDNA，在如下體系擴增：預變性95℃，3 min；變性95℃，30 s→退火55℃～60℃，30 s→延伸72℃，30 s；從變性至延伸持續(xù)35個循環(huán)；終止延伸72℃，10 min。DNA Marker 及各組待測樣本各取5 μl上樣，用0.5×Tris硼酸(TBE)溶液作為電泳液，電壓90～100 V，電泳30 min。④所得DNA條帶用Model Gel 2 000凝膠成像分析儀進行成像。以β-actin作為內部參照，用Bio-Image圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計數(shù)據。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析及協(xié)方差分析。

2 結 果

2.1 行為學變化 造模后各組頸部皮下注射阿樸嗎啡(APO)，注射1～5 min后大鼠開始出現(xiàn)以健側后肢為支點的旋轉，順時針方向，首尾相接。假手術組注射后并未出現(xiàn)旋轉行為，而模型組均出現(xiàn)旋轉行為；模型組(15.61±2.62)和天麻組(14.5±2.96)干預前旋轉圈數(shù)無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，經過治療后天麻組旋轉圈數(shù)(5.51±2.72)較模型組(14.45±2.55)明顯下降(P<0.05)。

2.2 各組Bcl-2及Bax mRNA的表達 各組內參GAPDH mRNA擴增條帶亮度強弱相似。以與GAPDH同比例的模板量加入，各組Bcl-2 mRNA與Bax mRNA RT-PCR的擴增條帶亮度具有明顯差異，與假手術組比較，Bcl-2 mRNA擴增條帶亮度顯著減弱，Bax mRNA擴增條帶亮度明顯增強(P<0.05)，其中模型組與天麻組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。干預后，與模型組比較，天麻組紋狀體Bcl-2 mRNA擴增條帶亮度明顯增強，Bax mRNA擴增條帶亮度明顯減弱(P<0.05)。見表1。

2.3 各組Bcl-2及Bax蛋白的表達 與假手術組比較，模型組及天麻組紋狀體Bcl-2明顯降低，Bax明顯升高(P<0.05)。干預前模型組與天麻組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。干預后，與模型組比較，天麻組紋狀體Bcl-2表達明顯增加，Bax水平明顯下降(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 各組Bcl-2、Bax mRNA及蛋白的表達

與假手術組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.01

圖1 3組Western印跡結果比較

3 討 論

APO誘發(fā)PD模型大鼠的旋轉行為是目前被視為較客觀的評價手段〔3～5〕，APO屬于DAD2受體激動劑，DAD2受體多存在于DA能神經元突出后膜，DA能神經元數(shù)量減少是PD的主要病理改變之一，有研究表明當灰質紋狀體DAD2受體減少超過70%時動物會出現(xiàn)動作僵硬遲緩等癥狀。隨著APO注射后，DAD2受體數(shù)量增多，導致大鼠出現(xiàn)去神經超敏現(xiàn)象，從而出現(xiàn)APO誘導的旋轉行為。天麻素是天麻的有效成分，具有明顯的鎮(zhèn)靜、抗驚厥效應?，F(xiàn)代藥理學證實天麻素可明顯擴張椎基底動脈系統(tǒng)，從而增加腦血流量，發(fā)揮保護腦神經、促進心肌細胞能量代謝的作用〔6～8〕。Bcl-2和Bax是目前較為公認的處于動態(tài)平衡的調控基因組，其中Bcl-2可抑制細胞的凋亡，Bax可誘導細胞凋亡，因此Bcl-2和Bax的表達量是抑制/誘發(fā)細胞凋亡的重要因素〔9〕。天麻注射液可調節(jié)Bcl-2家族成員的活性，抑制細胞凋亡蛋白 Bcl-2 發(fā)揮抗凋亡作用，還可以使促進細胞凋亡蛋白 Bax 磷酸化而失活，從而抑制細胞凋亡。推測，天麻素抗DA能神經元細胞凋亡很可能是其對PD動物模型保護作用的主要機制之一，天麻素如何實現(xiàn)其抗凋亡值得研究。

1 中華醫(yī)學會神經病學分會運動障礙及帕金森病學組.中國帕金森病治療指南(第 2 版)〔J〕.中華神經科雜志，2009；42(5)：352-5.

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3 Macinnes N，Duty S.Locomotor effects of imidazoline 12-site-specific ligands and monoamine oxidase inhibitors in rats with a unilateral 6-OHDA lesion of the nigrostriatal pathway〔J〕.J Br Pharmacol，2004；143(8)：952-9.

4 Sgambato-Faura V，Buggia V，Gilbert F，etal.Coordinated and spatial upregulation of arc in striatonigral neurons correlates with L-dopa-induced behavioral sensitization in dyskinetic rats〔J〕.J Neuropathol Exp Neurol，2005；64(11)：936-47.

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7 呂國平，王春芹.天麻素注射液的藥理及臨床研究〔J〕.中草藥，2002;33(5)：附3-5.

8 楊萬興，呂金勝，封永勇，等.天麻醇提液對動物急性炎癥的影響〔J〕.藥物研究，2002;11(12)：26.

9 Blesa J，Phani S，Jackson-Lewis V,etal.Classic and new animal models of Parkinson′s disease〔J〕.J Biomed Biotechnol，2012;2012:e845618.

〔2015-01-19修回〕

(編輯 苑云杰)

席 晅(1966-)，男，副教授，主要從事生理學研究。

R965.1

A

1005-9202(2016)20-4996-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.023

1 甘肅醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤內科