馬永臻

(山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東 臨沂 276000)

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紫杉醇和順鉑對(duì)KYSE150細(xì)胞增殖與凋亡的影響

馬永臻

(山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東 臨沂 276000)

目的 探討紫杉醇和順鉑對(duì)KYSE150細(xì)胞增殖與凋亡。方法 用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測紫杉醇和順鉑對(duì)KYSE150細(xì)胞增殖、遷移能力的影響；MTT法和免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測紫杉醇和順鉑對(duì)KYSE150細(xì)胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 紫杉醇和順鉑明顯抑制KYSE150細(xì)胞的增殖，降低其遷移能力(P<0.05)，且兩藥有協(xié)同抑制作用。紫杉醇和順鉑降低KYSE150細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 紫杉醇和順鉑對(duì)KYSE150細(xì)胞增殖和凋亡影響與Bax、Bcl-2和Caspase-3基因表達(dá)異常相關(guān)。

紫杉醇；順鉑；Bax；Bcl-2；Caspase-3；食管癌

早期食管癌的治療以手術(shù)切除為主，晚期常以化療為主，但食管癌發(fā)病隱匿，確診時(shí)大多已是中晚期，失去了根治的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致食管癌治療的總有效率并不高。因此，尋找對(duì)食管癌更有效的治療方法和化療藥物具有重要意義。紫杉醇和順鉑是臨床常用的食管癌化療藥物，但對(duì)其作用機(jī)制尚未完全清楚。食管癌的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡異常密切相關(guān)，而細(xì)胞凋亡又是由多種基因調(diào)控的，研究凋亡調(diào)控基因?qū)τ诹私馐彻馨┑陌l(fā)生、發(fā)展及治療都有重要意義。本文觀察紫杉醇和順鉑對(duì)食管癌KYSE150細(xì)胞增殖和凋亡的影響，檢測Bax、Bcl-2和Caspase-3基因表達(dá)變化，探紫杉醇和順鉑的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶和胎牛血清由杭州四季青公司提供。人食管癌KYSE150株由本實(shí)驗(yàn)室凍存。紫杉醇(分子量853.9)、順鉑(分子量300.05)由哈藥集團(tuán)生物工程有限公司提供，5%四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)由上海華美生物工程公司提供。兔抗人Bax、Bcl-2和Caspase-3單克隆抗體由美國Santa Cruz公司提供，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG、山羊封閉血清、二甲基亞砜(DMSO)、DAB顯色劑和PBS購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) KYSE150細(xì)胞接種于RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素)，常規(guī)培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液并傳代，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測

1.3.1 半數(shù)抑制濃度(IC50)測定 取100 μl含5×104個(gè)/ml細(xì)胞接種于96孔板。孵育12 h后，加入不同濃度的順鉑和紫杉醇，順鉑終濃度依次為4、8、16、32、64、128、256 μg/ml，紫杉醇終濃度分別為0.5、1、2、4、8、16、32 μg/ml，每孔100 μl，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以不含藥物的培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照孔，同樣設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl/孔，孵育4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加150 μl DMSO，振蕩10 min。用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光值(A)。細(xì)胞生長抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A)×100%。計(jì)算出順鉑、紫杉醇對(duì)人食管癌細(xì)胞KYSE150的IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 藥物聯(lián)合作用評(píng)價(jià) 細(xì)胞分如下4組：對(duì)照組、紫杉醇組、順鉑組和聯(lián)合組(紫杉醇+順鉑)，對(duì)照組不加藥物，紫杉醇和順鉑的濃度均為IC50。倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測藥物作用24、48、72 h后各組細(xì)胞的吸光值，比較不同藥物和用藥方式對(duì)KYSE150細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用兩藥相互作用指數(shù)(CDI)評(píng)價(jià)兩藥的相互作用〔1〕：CDI=AB/(A×B)，其中A、B是兩藥單獨(dú)作用吸光度值與對(duì)照組吸光度值的比值，AB為兩藥聯(lián)合組吸光度值與對(duì)照組吸光度值比值。CDI>1時(shí)，兩藥相互作用為拮抗作用；CDI=1，兩藥作用性質(zhì)為相加；CDI<1時(shí)，兩藥相互作用為協(xié)同。

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 KYSE150細(xì)胞按照1.3.2方法分組培養(yǎng)，至細(xì)胞完全貼壁后加紫杉醇和順鉑(均為IC50的濃度)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，涂片，固定，3%H2O2室溫孵育15 min，山羊血清孵育15 min。分別與Bax、Bcl-2和Caspase-3單克隆抗體37℃孵育2 h，PBS洗3次。二抗室溫孵育15 min，DAB顯色，封片，以培養(yǎng)液代替一抗作陰性對(duì)照。顯微鏡下觀察切片，以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒為陽性細(xì)胞，比較各組細(xì)胞陽性著色的位置和強(qiáng)度，計(jì)算KYSE150細(xì)胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)的陽性率。應(yīng)用Image J軟件和Image Proplus軟件對(duì)免疫組化圖像進(jìn)行半定量分析。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測紫杉醇和順鉑對(duì)KYSE150細(xì)胞生長和遷移的影響 取對(duì)數(shù)期各組細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度為5×103個(gè)/孔，待細(xì)胞貼壁成單層細(xì)胞后，用消毒槍頭均勻劃4條橫線，用PBS洗去劃下的細(xì)胞，換成含1.5%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37°C，5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察0、24、48 h劃痕愈合情況，用Image Proplus軟件測量各組細(xì)胞24 h的遷移距離，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 IC50測定 見表1。隨著紫杉醇和順鉑濃度增加，KYSE150細(xì)胞的抑制率也增加，當(dāng)紫杉醇濃度為8 μg/ml、順鉑的濃度為64 μg/ml時(shí)，細(xì)胞的抑制率近半數(shù)，因此，可以認(rèn)為紫杉醇的IC50為8 μg/ml，順鉑的IC50為64 μg/ml。

表1 紫衫醇和順鉑IC50測定

2.2 紫杉醇和順鉑對(duì)KYSE150細(xì)胞增殖的影響 顯微鏡下觀察，紫杉醇組、順鉑組和聯(lián)合組細(xì)胞稀疏，形態(tài)皺縮、變圓，胞核固縮；對(duì)照組細(xì)胞密集，貼壁良好，形態(tài)規(guī)則，多邊形。說明紫杉醇和順鉑對(duì)食管癌細(xì)胞有明顯的抑制作用。紫杉醇和順鉑對(duì)KYSE150細(xì)胞增殖抑制作用并無時(shí)間依賴性，48 h時(shí)抑制作用最強(qiáng)(CDI=0.742)，72 h后抑制作用減弱(CDI=0.922),24 h時(shí)CDI=0.878；各時(shí)間點(diǎn)CDI<1，說明紫杉醇和順鉑有協(xié)同作用，而且48 h協(xié)同作用最強(qiáng)。見表2。

表2 紫杉醇和順鉑作用不同時(shí)間的平均吸光度值比較

與同組別其他時(shí)間點(diǎn)比較：1)P<0.05;與同時(shí)間點(diǎn)其他組比較：2)P<0.05

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果 各組平均灰度值見表3，各用藥組Bcl-2蛋白的表達(dá)均低于對(duì)照組，Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)均高于對(duì)照組。應(yīng)用Image J軟件對(duì)免疫組化圖像進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，見表4，陽性細(xì)胞越多，說明表達(dá)Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達(dá)越多(P<0.05)。

表3 Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)的平均灰度值

與對(duì)照組比較:1)P<0.05，下表同

表4 免疫組化圖像陽性細(xì)胞數(shù)分析(%,n=100)

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞生長較快，48 h后細(xì)胞已經(jīng)長滿劃痕部位，而順鉑組細(xì)胞生長緩慢，48 h后劃痕部位沒有長滿。用Image Proplus軟件測量各組細(xì)胞24 h的遷移距離，結(jié)果表明對(duì)照組遷移距離明顯大于順鉑組(P<0.05)，見表5。

表5 各組細(xì)胞24 h、48 h遷移距離

3 討 論

紫杉醇和順鉑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食管癌的治療，效果較好〔2,3〕。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著紫杉醇和順鉑濃度的增加，對(duì)KYSE150細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)紫杉醇濃度為8 μg/ml、順鉑的濃度為64 μg/ml時(shí)，細(xì)胞的抑制率近半數(shù)，但紫杉醇和順鉑的抑制作用并無時(shí)間依賴性，48 h時(shí)抑制作用最強(qiáng)，72 h后抑制作用減弱，而且紫杉醇和順鉑有協(xié)同作用。章曉萍等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)，順鉑與吉非替尼聯(lián)合用藥對(duì)食道癌Eca-109細(xì)胞有協(xié)同抑制作用，細(xì)胞的生長抑制率均隨著給藥濃度的增加和時(shí)間的延長而提高,順鉑組具有時(shí)間濃度依賴性,與本研究略有不同之處。

細(xì)胞增殖失控是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特征，細(xì)胞增殖與凋亡失衡是食管癌發(fā)生的重要原因，細(xì)胞凋亡又受許多基因的調(diào)控，其中Bax、Bcl-2和Caspase-3都與細(xì)胞凋亡有關(guān)?？紫嫉取?〕研究證實(shí)，順鉑與紫杉醇聯(lián)合可協(xié)同誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)凋亡抑制基因的表達(dá)有關(guān)。原癌基因Bcl-2基因家族及其相關(guān)蛋白是研究最早的與凋亡有關(guān)的基因，也是目前最受重視的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族〔6〕。Bcl-2家族成員分為兩大類：促凋亡類，如Bid、Bax、Bak等；抑凋亡類，如Bcl-2、Bcl-x1等，這2類蛋白可通過形成異二聚體發(fā)揮相互拮抗或協(xié)同作用〔7〕。Bcl-2基因高表達(dá)可以抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞的存活，而對(duì)細(xì)胞增殖無影響。

Bax基因定位于染色體19q13.3-19q13.4,含有6個(gè)外顯子5個(gè)內(nèi)含子。Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bax形成同源二聚體時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Bax與Bcl-2形成異源二聚體時(shí)則實(shí)現(xiàn)了Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的功能〔7〕。

本研究說明紫杉醇和順鉑使得Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax和Caspase-3的表達(dá)增高，對(duì)KYSE150細(xì)胞凋亡的抑制作用減弱，誘導(dǎo)凋亡的作用增強(qiáng)，從而抑制細(xì)胞的增殖，抑制食管癌的進(jìn)一步發(fā)展。這一結(jié)果與某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致〔8,9〕。

細(xì)胞凋亡是非常復(fù)雜的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程。目前認(rèn)為藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡受一個(gè)或多個(gè)基因的調(diào)控〔10〕。眾所周知，Caspase-3為與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白酶家族〔11〕。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的典型途徑包括：對(duì)Caspase-3的依賴性(細(xì)胞外途徑)和對(duì)線粒體靶向性(細(xì)胞內(nèi)途徑)，而Caspase-3是兩種細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵酶和執(zhí)行者，是級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。由于活化的Caspase-3能特異性地切斷DNA，使參與DNA損傷修復(fù)過程中的DNA依賴蛋白激酶(DNA-PK)和聚ADP核糖聚合酶(PARP)失活，導(dǎo)致核酸激活和染色質(zhì)聚集，促使細(xì)胞凋亡。Odonkor等〔12〕研究結(jié)果表明，Caspase-3依賴性途徑是Paclitaxel細(xì)胞毒性作用的重要途徑，Caspase活化和效能對(duì)Paclitaxel治療腫瘤的敏感性具有良好的指示作用。劉圓圓等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)茶多酚能抑制Eca-109細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期阻滯在G1期的比例增高；兩藥聯(lián)合其作用更明顯，其機(jī)制可能與Caspase-3 mRNA表達(dá)增高有關(guān)。從作用機(jī)制而言，Bcl-2不僅可能通過抑制細(xì)胞色素C從線粒體的釋放而調(diào)控線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的開啟從而抑制Caspase-3的活化，還可能參與抑制Caspase-3的合成〔14〕。

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〔2015-04-15修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃(2011HZ098)

馬永臻(1970-)，女，碩士，教授，主要從事腫瘤病理研究。

R735.1

A

1005-9202(2016)20-4973-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.014