劉晉津，劉 群，吳 騰，郝志明

（1．天津市南開醫(yī)院，天津 300100；2．天津市西青區(qū)畜牧水產(chǎn)發(fā)展服務(wù)中心，天津 300380；3．天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384）

甘油濃度、去甲腎上腺素對豬精液冷凍保存的研究

劉晉津1，劉 群2，吳 騰1，郝志明3

（1．天津市南開醫(yī)院，天津 300100；2．天津市西青區(qū)畜牧水產(chǎn)發(fā)展服務(wù)中心，天津 300380；3．天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384）

該試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，就甘油濃度和去甲腎上腺素對豬精液的冷凍保存做了進(jìn)一步探究。結(jié)果表明：4%甘油濃度凍后精子活率最佳，為0．483 ±0．698。而添加去甲腎上腺素并不能明顯提高豬凍后精子活率，15 μL組效果略好。

豬；甘油濃度；去甲腎上腺素；精液；冷凍

豬作為人們主要的家畜之一，有其獨(dú)特的畜產(chǎn)品價(jià)值。隨著飼養(yǎng)條件的改善以及繁殖學(xué)的發(fā)展，鮮精的配種不利于長途運(yùn)輸，因此豬精液的冷凍保存也被越來越多的人關(guān)注。但是由于豬凍精繁殖率較低使其凍精在全球人工授精的比例不足一個(gè)百分點(diǎn)［1］。綜上，研究豬精液的冷凍保存就有著現(xiàn)實(shí)意義。

Polge于1956年首次對豬精液冷凍并獲得成功［2］。但是與牛羊相比，豬的精液冷凍難度相對較大［3］。影響豬精液的冷凍保存有諸多因素，Abeydeear［4］在20世紀(jì)90年代對稀釋液進(jìn)行過研究，胡傳活等人研究發(fā)現(xiàn)，稀釋液中加入20%的卵黃，精子活率最好［5］。在過去幾十年的研究中，冷凍保護(hù)劑的出現(xiàn)使豬精液的冷凍保存大步發(fā)展，殷方芝等［6］人發(fā)現(xiàn)，沒有一種保護(hù)劑比甘油效果更為出色，一般甘油濃度多為2%～3%。宋春青［7］研究發(fā)現(xiàn)去甲腎上腺素可以提高犬精液低溫保存的活率。在實(shí)際生產(chǎn)中，大都也是讓公畜爬跨幾次來增加去甲腎上腺素的分泌。本試驗(yàn)在前人努力研究的基礎(chǔ)上，對甘油濃度和稀釋液中加入去甲腎上腺素進(jìn)行研究，探討更有利于豬精液冷凍保存的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

長白豬8頭，雄性，性成熟，精液品質(zhì)良好。

1.2 稀釋液配置

雙蒸水中加入Tris-葡萄糖-檸檬酸-青霉素-鏈霉素，配置成基礎(chǔ)稀釋液，后用等體積80%的基礎(chǔ)液加入20%的卵黃配置成I液，再將I液分別加入體積分?jǐn)?shù)分別為2%，3%，4%的甘油配置成II液（對照組）。

1.3 精液稀釋處理

新鮮采集的精液經(jīng)過處理后檢查精子的活性和密度，在室溫下靜置2 h。調(diào)試離心機(jī)，以1 000 r/min離心5 min，去除上清液，緩慢加入等溫的I液后封口，放入盛有等溫水的燒杯中，將燒杯放入4 ℃冰箱降溫平衡。

將已降溫至4 ℃的精液分別加入等溫的含有不同比例甘油的II液后繼續(xù)在4 ℃冰箱平衡4 h。

1.4 精液冷凍和解凍

在4 ℃狀態(tài)下，將已經(jīng)平衡好的精液分裝在0．25 mm的細(xì)管內(nèi)，封口后將細(xì)管插入已經(jīng)預(yù)冷到-70 ℃的細(xì)管插座內(nèi)，在液氮面上3 cm處熏蒸10 min后立即放入液氮罐內(nèi)。

從液氮罐中快速取出精液細(xì)管，在38 ℃水浴中解凍30 s，在400倍鏡下觀測精子活率。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)按單因子試驗(yàn)進(jìn)行分析，各組間進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2.1 甘油濃度對凍后精子活性的影響

表1結(jié)果表明，甘油濃度為4%凍后精子活率為0．483 ±0．698，顯著高于甘油濃度為2%和3%的精子活率（P＜0．05），而后兩者之間并沒有顯著差異（P＞0．05)。

圖1 顯微鏡下觀察精子活率

圖2 豬精

2.2 去甲腎上腺素對凍后精子活率的影響

從表1試驗(yàn)結(jié)果表明，4%甘油濃度的精子活率最好，所以本組試驗(yàn)采用的甘油濃度為4%。在4%甘油濃度的II液中分別加入體積分?jǐn)?shù)為5 μL，10 μL，15 μL的去甲腎上腺素配置成試驗(yàn)組用液。

從表2試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然加入15 μL去甲腎上腺素的試驗(yàn)組精子活率最好，但是去甲腎上腺素不同含量的3組與對照組比較都沒有明顯差異（P＞0．05)。可見3個(gè)不同劑量的去甲腎上腺素并不能對凍后精子的活率產(chǎn)生影響。

表1 甘油濃度對凍后精子活性的影響

表2 去甲腎上腺素對凍后精子活率影響

3 討論

甘油又名丙三醇，其分子結(jié)構(gòu)中3個(gè)羥基為親水基團(tuán)，可以和精液中的水結(jié)合，限制或者干擾水分子的晶格排列，產(chǎn)生冰晶。而其烴鏈為疏水基團(tuán)，可阻止精子內(nèi)水分相互滲透，從而產(chǎn)生保護(hù)作用。甘油是動(dòng)物精子凍存最為常用的保護(hù)劑，而甘油的濃度在不同牲畜凍精研究中用量也不同，例如牛的凍精中適宜甘油濃度為6%左右［8］。Fahy［9］對甘油濃度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)2%體積分?jǐn)?shù)的甘油冷凍效果最佳，5%最差，高濃度的甘油反而會(huì)造成精子的損傷［10］，這與我國研究人員殷方芝的研究結(jié)果相類似。我們在試驗(yàn)中又對2%～4%的甘油濃度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)就豬的凍精活率而言，4%效果最好，為0．483 ±0．698。

去甲腎上腺素是由交感神經(jīng)分泌的一種神經(jīng)遞質(zhì)，同時(shí)也是一種激素。當(dāng)公畜射精時(shí)，交感神經(jīng)興奮，去甲腎上腺素分泌增加，從而可以提高射精量和精液的品質(zhì)，即精子活率升高。試驗(yàn)研究表明，去甲腎上腺素可以明顯延長豬精子低溫保存的存活時(shí)間，本試驗(yàn)對去甲腎上腺素對冷凍精子活率進(jìn)行研究，就3個(gè)劑量而言，效果并不明顯，15 μL的劑量組效果略微突出，也可能再加大一些去甲腎上腺素的劑量，會(huì)有顯著差別，這一點(diǎn)有待繼續(xù)研究。那么，為什么去甲腎上腺素可以明顯延長豬精液低溫保存時(shí)間而對冷凍保存效果不明顯呢？其中原因我們還并不十分清楚，也可能去甲腎上腺素在低溫保存過程中降低了精子本身的耗能，但是由于冷凍溫度過低，使這種保護(hù)作用消失。

［1］ 禚艷書，王堅(jiān)，劉鐵錚．豬精液冷凍保存研究進(jìn)展［J］．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（3）：136-140．

［2］ POLGE C．Artificial insemination in pigs［J］．Vet Pec，1956（68）：62-76．

［3］ 李青旺，江中良，王立強(qiáng)，等．豬精液冷凍保存的初步研究［J］．西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，31（4）：63-66．

［4］ ABEYDEEAR L R，DAY B N．Fertilization and subsequent development in vitro of pig oocytes inseminated in a modified Tris-buffered medium with frozenthawed ejaculated spermatozoa［J］．Biol Reprod，1997（57）：729-734．

［5］ 胡傳活，孫艷艷，胡傳水，等．稀釋液中卵黃濃度對豬精液冷凍保存效果的影響［J］．廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，41（6）：609-611．

［6］ 殷方芝，戴建軍，張德福．豬精液大劑型冷凍保存的研究進(jìn)展［J］．國外畜牧學(xué)：豬與禽，2008（1）：66-68．

［7］ 宋春青，郝志明，劉洪柱，等．去甲腎上腺素和睪酮對低溫保存犬精子的影響［J］．畜牧獸醫(yī)科技信息，2009（4）：46-48．

［8］ 李青旺，武浩．動(dòng)物繁殖學(xué)［M］．西安：西安地圖出版社，2000．

［9］ FAHY G M．Effect of rapid warming of boar semen on sperm morphology and physiology［J］．Cryobiology，1986（23）：1-13．

［10］ 姜興剛，趙桂英，和紹禹，等．冷凍前離心方法、平衡時(shí)間、甘油濃度對豬精子冷凍保存的影響［J］．黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008（6）：42-43．

2016-02-18)