謝蘭曼+祝燕+沈雪林+胡建新

摘要：為研究勛章菊授粉形式對種子形成的影響，對其花粉鞘及蛋白成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明，黃色花粉外層含有類胡蘿卜素，經(jīng)板層分析得到與標(biāo)準(zhǔn)樣品β-胡蘿卜素具有相同的比移值（Rf值）；經(jīng)花粉表面蛋白色譜-質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，大多為30～50 ku；通過搜索、比對蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)，其中較可信的蛋白有3種，它們的肽段屬于驅(qū)動(dòng)蛋白馬達(dá)結(jié)構(gòu)域，在各自有絲分裂過程中參與染色體的運(yùn)動(dòng)和主軸伸長。該結(jié)果可為研究菊科植物自交及異交的親和機(jī)制提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：勛章菊；花粉鞘；蛋白質(zhì)；花粉；色素

中圖分類號： S682.1+10.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0332-02

勛章菊為菊科勛章菊屬植物，花形奇特，花色多彩，花心具深色眼斑，形似勛章，具濃厚的野趣，是園林中常見的盆栽和花壇、及地被花卉植物，對勛章菊開展相關(guān)研究，為其在園林中應(yīng)用開辟更廣闊的前景。

植物開花后，須要經(jīng)過花粉萌發(fā)、花粉管進(jìn)入胚囊和配子融合等一系列過程才能完成受精作用[1]。其中，最為關(guān)鍵性的一步就是花粉在柱頭上的識別，對完成受精起著決定性作用。馬紀(jì)峰等研究表明，柱頭通過分泌某些物質(zhì)主動(dòng)地參與花粉與柱頭的識別過程[2]，而花粉粒的初始識別是由花粉鞘調(diào)節(jié)的，花粉鞘是由花藥絨氈層分泌并沉積于花粉表面的中性脂類、碳水化合物、蛋白質(zhì)和類胡蘿卜素等組成的半固態(tài)覆蓋層[3-4]?；ǚ哿：痛迫镏^組織間產(chǎn)生的蛋白質(zhì)則是識別作用的主要物質(zhì)[5]。勛章菊的管狀花之間的傳花授粉有別于其他菊科植物，花粉表面的一些小分子組成的胞外層物質(zhì)參與了花粉的水合反應(yīng)。為了探明授粉形式（自花和異花）對種子形成的影響，本研究對勛章菊花粉鞘及其成分進(jìn)行了分析，以期為研究菊科植物自交及異交的親和機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以紅紋品種為材料，選取盆栽開花植株進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 花粉表面色素層析 取開放的紅紋頭狀花序，小心摘取管狀花8～10朵，用蒸餾水觀察花粉鞘的剝離；用80%丙酮溶液將柱頭上的花粉洗下，4 000 r/min離心后上清液即為花粉的色素提取液。取色素提取液10 μL點(diǎn)樣于10 cm×10 cm的硅膠板上，以β-胡蘿卜素為對照，在石油醚 ∶丙酮=65 ∶35的展開劑中展開15 min，取出硅膠板置室內(nèi)晾干，在WD-9403型紫外儀下進(jìn)行觀察[4]。

1.2.2 花粉表面蛋白SDS-PAGE 取0.5 mL離心管加入60 μL提取緩沖液，取紅紋頭狀花序，小心摘取8～10朵剛剛開放、柱頭呈蠟燭狀的管狀花，放入離心管中，浸提2 h；取8～10朵柱頭呈牛角狀的管狀花，觀察是否附著花粉，選擇無花粉附著的柱頭置離心管中浸提2 h，搖勻后沸水浴10 min，靜置，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳選擇濃縮膠5%、分離膠8%、1.5 mm厚膠板[6]。

SDS-PAGE采用DYY-10型電泳儀，1.5 mm膠板，提前配制8%分離膠及5%濃縮膠，制好后取蛋白上清液上樣40 μL，室溫電泳至溴酚藍(lán)指示帶距凝膠底邊3～5 mm時(shí)停止。將凝膠放入染色液中染色1 h，置于脫色液（5%甲醇，7.5%冰醋酸）中脫至蛋白譜帶清晰、背景顏色干凈，用相機(jī)拍攝凝膠電泳圖像[7]。

1.2.3 花粉表面蛋白質(zhì)譜分析 將凝膠上目的蛋白條帶切膠回收，放入1.5 mL離心管中，冷凍密封保存，采用Thermo Finnigan公司的離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀（LCQ Deca XP plus）對樣品進(jìn)行LC-MS/MS分析[8]。膠的酶解和質(zhì)譜分析委托上海中科新生命生物科技有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉表面色素定性分析

在勛章菊開花中期和后期，會(huì)出現(xiàn)黃色和白色2種花粉，在顯微鏡下觀察，黃色花粉表面附著1層黃色油性覆蓋物，即花粉鞘，花粉鞘在水體中會(huì)快速釋放，并作短暫的布朗運(yùn)動(dòng)（圖1-a）?；ǚ矍式?jīng)過80%丙酮提取后，與標(biāo)準(zhǔn)樣品（β-胡蘿卜素）同時(shí)薄板層析，結(jié)果表明，花粉中所含的色素與β-胡蘿卜素有相同的比移值（Rf，6.0/6.0=1）[9]。初步確定勛章菊花粉色素為β-胡蘿卜素（圖1-b、圖1-c）。而白色花粉的花粉鞘中不含類胡蘿卜素。

2.2 花粉表面蛋白SDS-PAGE

取紅紋花粉、柱頭提取液進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果（圖2）表明，無論是蒸餾水提取還是樣品緩沖液提取，對花粉和柱頭表面蛋白的SDS-PAGE結(jié)果影響不大?；ǚ郾砻娴鞍状蠖酁?0～50 ku，在此區(qū)間內(nèi)條帶較粗，蛋白含量高；而柱頭由于蛋白提取技術(shù)及蛋白含量低的原因，未能獲得有效條帶。

2.3 花粉表面蛋白質(zhì)譜分析

用8% 分離膠對花粉表面蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，切下的膠經(jīng)酶解成肽段混合物后，進(jìn)行色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的LC-ESI MS/MS分析[10]，得出的一級質(zhì)譜圖，利用MS分析數(shù)據(jù)，通過BIOWORKS軟件搜索NCBI全蛋白庫，比對22種蛋白，其中比較可信的蛋白有6種，鑒定成功的有3種。3種蛋白的等電點(diǎn)范圍為5.84～8.16，蛋白分子量范圍為817 24.2～102 996.9 u。比對了毛楊果（Populus trichocarpa）、小球藻、栓皮櫟（Chlorella variabilis）、水稻（Oryza sativa Japonica Group）、綠藻（Ostreococcus tauri）等肽段序列，發(fā)現(xiàn)與毛楊果的一個(gè)肽段序列及葡萄（Vitis vinifera）的2個(gè)肽段序列同源性非常高。與毛楊果同源的肽段屬于驅(qū)動(dòng)蛋白馬達(dá)結(jié)構(gòu)域，CENP-E/KIP2-like組分，它們在有絲分裂過程中參與染色體的運(yùn)動(dòng)和主軸伸長，在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸和細(xì)胞分裂中發(fā)揮重要作用[11]。

3 結(jié)論與討論

3.1 勛章菊花粉表面色素分析

花粉表面覆蓋物（花粉鞘）的成分較為豐富，其主要成分為孢粉素、纖維素、類胡蘿素、類黃酮素、脂類、糖類及蛋白質(zhì)等，這一特征不僅貯藏著受精過程的信息物質(zhì)，而且在花粉生態(tài)學(xué)中具有重要意義[12]，其中色素在植物受精生理過程中充當(dāng)著重要保護(hù)者的角色，它能有效地阻截紫外線對花粉生命力的損傷，胡蘿卜素在花粉表面的富集，使紫外線對花粉的傷害降到最低[13]。勛章菊的花粉大多是黃色的，當(dāng)花粉成熟時(shí)，花粉粒撒在聚藥雄蕊的“筒”中，待雌蕊花柱伸長時(shí)，成熟花粉粒粘在柱頭的外表面被“推”出筒外。但“推”出后的第2天，花粉即由黃色變?yōu)榘咨?，這是由于花粉表面的β-胡蘿卜素經(jīng)太陽光照射后降解所引起的[13]。但白色花粉與黃色花粉在萌發(fā)、受精方面是否存在差異還需要進(jìn)一步研究闡明。

3.2 花粉表面蛋白SDS-PAGE

研究表明，孢子體自交不親和系統(tǒng)的花粉與柱頭的識別機(jī)制是由S等位基因編碼的S蛋白質(zhì)決定的，本試驗(yàn)通過對勛章菊花粉、柱頭的表面蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析，以探討表面蛋白對于受精生理的影響。對于勛章菊花粉和柱頭表面蛋白的提取，蒸餾水和樣品緩沖液的效果相似，沒有明顯區(qū)別。由于試驗(yàn)材料的特殊性（花粉粒、柱頭體積小，樣品取樣難度大，柱頭切口易流出組織液影響樣品提取等），導(dǎo)致凝膠電泳未能分離出更多的清晰條帶。

3.3 花粉表面蛋白質(zhì)譜分析

花粉表面蛋白除了參與黏附作用之外，還參與花粉的水合作用。大部分植物的花粉粒在叢花藥中釋放之后都是高度失水的，代謝活動(dòng)處于很低的狀態(tài)。花粉表面蛋白還參與了花粉與柱頭的信號識別過程，直接影響花粉的萌發(fā)[14]。本試驗(yàn)對勛章菊花粉表面蛋白的質(zhì)譜分析表明，與葡萄同源的肽段在序列長為35個(gè)氨基酸的位置，通常發(fā)現(xiàn)在4個(gè)或更多的串聯(lián)拷貝，這些具有一定代表性的植物蛋白對葉綠體或線粒體的排序具有重要影響。

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