摘要：為建立測(cè)定桃花中黃酮含量的紫外分光光度法和探索超聲波輔助下黃酮最佳提取工藝條件，以槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)品，用紫外可見分光光度計(jì)UV-2450進(jìn)行黃酮含量測(cè)定，測(cè)定波長(zhǎng)為372 nm；通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化超聲波下提取桃花中黃酮的最佳工藝。結(jié)果表明，槲皮素的回歸曲線方程為D=11.625C+0.028，在0.004～0.048 mg/mL 線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為r=0.999 7，桃花中黃酮含量為5.24%；最佳工藝條件：超聲功率為80 W，料液比為1 g ∶20 mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%；超聲波時(shí)間為75 min。由結(jié)果可知：以槲皮素為對(duì)照品，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定桃花中黃酮含量操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性好；用超聲波輔助法提取桃花中黃酮工藝簡(jiǎn)單，提取率高。

關(guān)鍵詞：桃花；紫外分光光度法；黃酮；含量測(cè)定；提取工藝

中圖分類號(hào)： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0329-03

桃花是薔薇科落葉喬木——桃樹的花，無論是中醫(yī)經(jīng)典著作，還是在民間的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)方面，都認(rèn)為桃花具有較好的藥用和食療價(jià)值，如最早的藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》里就提到桃花具有“令人好顏色”之功效；李時(shí)珍在《本草綱目》中記載：“桃花，性走泄下降，利大腸甚快，用以制氣室入病水飲腫滿，積滯、大小便閉塞者，則有功無害，若久服即耗人陰血，損元?dú)狻薄疤一?，性平無毒，活血利水；可輕身，令人好顏”；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明：桃花具有廣泛的藥理活性，能疏通經(jīng)絡(luò)，擴(kuò)張末稍毛細(xì)血管、改善血液循環(huán)，促進(jìn)皮膚營(yíng)養(yǎng)和氧供給，滋潤(rùn)皮膚、防止色素在皮膚內(nèi)慢性沉積，有效地清除體表中的黃褐斑、雀斑、黑斑等功效[1-2]。研究表明，桃花中含有山奈酚、多糖、黃酮等成分[3]。黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抗輻射等多種藥理作用[4-8]。本試驗(yàn)通過對(duì)桃花中黃酮含量測(cè)定方法和提取工藝進(jìn)行探索，為進(jìn)一步研究桃花的藥理和開發(fā)桃花的藥用價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桃花（采于寧夏固原市原州區(qū)寧夏師范學(xué)院校園），將所采桃花樣品用蒸餾水洗凈，瀝干，放入恒溫箱中，在60 ℃烘干至恒質(zhì)量，自然陰干、粉碎，作為供試樣品。槲皮素標(biāo)準(zhǔn)（上海源葉生物科技有限公司提供，批號(hào)：20121113，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，均為分析純。

1.2 主要試驗(yàn)儀器

SK300LHC超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；UV-2450型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）；FA2204B電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用電子天平準(zhǔn)確稱取120℃干燥至恒質(zhì)量的槲皮素對(duì)照品5.0 mg，置于25 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇至刻度，搖勻，轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，即得槲皮素儲(chǔ)備液（0.2 mg/mL）。分別吸取槲皮素儲(chǔ)備液0、1、2、3、4、5、6 mL移入25 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為90%乙醇補(bǔ)至6 mL；分別加1 mL 5%亞硝酸鈉混勻，放置6 min，加1 mL 10% 硝酸鋁溶液搖勻，放置6 min，加10 mL 4%氫氧化鈉溶液，再加體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min。以試劑作空白參比液，在250～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)最大吸收波長(zhǎng)為372 nm，在372 nm下測(cè)吸光度，以槲皮素濃度（C）為橫坐標(biāo)、吸光度（D）為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得回歸方程：D=11.625C+0.028，r=0.999 7，表明在0.008～0.048 mg/mL濃度內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

1.3.2 桃花中黃酮的提取

準(zhǔn)確稱取適量預(yù)處理過的桃花樣品，按一定的乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比浸潤(rùn)30 min，在一定的功率下，超聲波處理數(shù)分鐘，浸提過濾，將濾渣在同樣條件下再浸提1次，合并2次所得濾液，將濾液轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用90%乙醇定容至刻度，作為供試液待測(cè)。

1.3.3 桃花中黃酮含量的測(cè)定

準(zhǔn)確移取1 mL提取黃酮樣品液置于25 mL容量瓶中，參照槲皮素對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的方法配制樣品溶液，并定容至25 mL，在372 nm下測(cè)樣品的吸光度，相關(guān)公式：

黃酮的提取量（g/mL）=稀釋倍數(shù)×10-3×黃酮濃度（mg/mL）×100 mL；

黃酮含量=黃酮的提取量×100 mL/桃花樣品質(zhì)量×100%。

1.3.4 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1.00 g預(yù)處理的桃花樣品，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇20 mL浸潤(rùn)30 min，在功率80 W下，超聲處理60 min，精確吸取提取液1 mL，置于25 mL容量瓶中，參照槲皮素對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的方法配制樣品溶液，并定容至25 mL，以試劑作空白參比液，在372 nm下測(cè)其吸光度。連續(xù)測(cè)定6次，RSD=0.61%，表明該試驗(yàn)方法精密度較好。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“1.3.4”節(jié)所得黃酮提取液1 mL，以試劑作空白參比液，每隔30 min，在372 nm處測(cè)其吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，RSD=0.46%，表明提取液在3 h內(nèi)較穩(wěn)定。

1.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理的桃花樣品1 g，按“1.3.4”節(jié)方法平行制備3份黃酮提取液，并按“1.3.5”節(jié)方法試驗(yàn)，RSD=0.28%，說明該方法重復(fù)性較好。

1.3.7 加樣回收率試驗(yàn)

取6份已知黃酮含量（5.24%）的桃花樣品0.2 g，分別精密加入低、中、高濃度的槲皮素對(duì)照品，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇，料液比1 g ∶20 mL浸潤(rùn)30 min，固定超聲功率80 W，超聲時(shí)間60 min，制備供試樣品溶液。準(zhǔn)確取供試溶液1 mL，置于5 mL容量瓶中，并按照槲皮素對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的方法顯色，在372 nm處測(cè)定吸光度，平均回收率為101.62%，RSD=1.63%。

1.3.8 桃花中黃酮提取工藝優(yōu)化

利用單因素試驗(yàn)法分別考察溶劑體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲波功率和超聲波時(shí)間4個(gè)因素對(duì)黃酮提取率的影響。同時(shí)為了綜合考察多因素對(duì)提取過程中提取率的影響，采用4因素3水平正交試驗(yàn)對(duì)提取過程中溶劑體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、超聲時(shí)間（C）和超聲功率（D）進(jìn)行研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)桃花中黃酮提取率的影響

2.1.1 溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率的影響 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過的桃花樣品1.00 g，各4份，分別用體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%乙醇，料液比為1 g ∶10 mL浸潤(rùn)30 min，然后在超聲波功率80 W、超聲波時(shí)間60 min條件下進(jìn)行試驗(yàn)。黃酮的提取率分別為4.13%、4.24%、4.56%、4.29%。結(jié)果表明，試驗(yàn)開始隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，桃花中黃酮的提取率也隨之增大。原因可能是隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，黃酮類化合物的溶解度隨之增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)達(dá)到最大值；隨后，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，提取率開始逐漸降低，可能是較大體積分?jǐn)?shù)的乙醇會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，黃酮類化合物難以溶出，綜合結(jié)果，提取率又開始降低。綜合結(jié)果，確定提取桃花中黃酮最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.1.2 料液比對(duì)黃酮提取率的影響 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過的桃花樣品1.00 g，各4份，固定乙醇的體積分?jǐn)?shù)為60%，按料液比為1 g ∶10 mL、1 g ∶15 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL浸潤(rùn)30 min，然后在超聲波功率80 W、超聲波時(shí)間為60 min條件下進(jìn)行試驗(yàn)，黃酮的提取率依次為3.35%、3.52%、4.38%、4.02%。試驗(yàn)表明，桃花中黃酮的提取率開始隨著料液比的增大而提高，但當(dāng)料液比大于1 g ∶20 mL時(shí)，黃酮的提取率開始下降。這可能是因?yàn)榱弦罕仍酱?，溶劑與原料接觸越充分，兩者的傳質(zhì)作用增強(qiáng)，黃酮的提取率升高。但當(dāng)料液比大于1 g ∶20 mL時(shí)，隨著料液比的增大，提取物中雜質(zhì)會(huì)增加，而這些雜質(zhì)會(huì)吸附部分黃酮，造成黃酮損失，提取率下降。因此確定1 g ∶20 mL是桃花中黃酮提取最佳的料液比。

2.1.3 超聲波時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響 準(zhǔn)確稱取桃花樣品1.00 g，各4份，固定乙醇的體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比為1 g ∶20 mL 浸潤(rùn)30 min，超聲波功率80 W，依次在超聲波時(shí)間為30、45、60、75 min下進(jìn)行試驗(yàn)，黃酮的提取率依次為4.29%、4.43%、4.62%、4.63%。試驗(yàn)結(jié)果表明，黃酮的提取率隨著超聲時(shí)間的增加而提高，這是由于隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮被萃取的程度增大，當(dāng)超聲時(shí)間大于60 min時(shí)，隨著超聲時(shí)間的再增加，提取率增大的趨勢(shì)明顯趨于緩慢，為了節(jié)約時(shí)間，確定60 min是超聲波的適宜時(shí)間。

2.1.4 超聲功率對(duì)黃酮提取率的影響 準(zhǔn)確稱取桃花樣品1.00 g，各4份，固定乙醇的體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1 g ∶20 mL 浸潤(rùn)30 min，超聲時(shí)間60 min，依次在超聲功率為40、60、80、100 W下進(jìn)行試驗(yàn)，黃酮的提取率依次為4.14%、4.28%、4.72%、4.64%。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著超聲功率的升高，黃酮的提取率先升高后降低，在80W時(shí)黃酮的提取率達(dá)到最大值。這可能是隨著超聲功率的增大，對(duì)細(xì)胞壁的破碎作用加強(qiáng)，在加速黃酮溶解的同時(shí)雜質(zhì)的溶解量也在增大，由于雜質(zhì)對(duì)黃酮的吸附，黃酮的提取率沒有提高反而下降。故確定提取桃花中黃酮適宜的超聲功率為80 W。

2.2 多因素對(duì)桃花中黃酮提取率的影響

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定各因素的合理水平見表1，本試驗(yàn)為3水平4因素的試驗(yàn)，故選用L9（34）正交表安排試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2直觀分析表明，影響超聲波輔助下桃花中黃酮提取的主要因素是乙醇的體積分?jǐn)?shù)，影響因素大小依次為A>D>C>B，即乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲波功率>超聲波時(shí)間>料液比，最佳工藝條件是A2B2C3D2。

方差分析結(jié)果表明，溶劑體積分?jǐn)?shù)和超聲功率是超聲波提取桃花中黃酮主要的影響因素，而料液比和超聲波時(shí)間對(duì)提取率影響不明顯（表3）。因此，在提取過程中應(yīng)該控制好乙醇的體積分?jǐn)?shù)和超聲波功率，而可以適當(dāng)減少超聲波時(shí)間，降低料液比。

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

稱取適量預(yù)處理過的桃花樣品，在正交試驗(yàn)所得優(yōu)化提取工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，黃酮的得率為5.24%（n=3）。

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，以槲皮素為對(duì)照品，用紫外可見分光光度法測(cè)定桃花中黃酮的含量操作簡(jiǎn)便，加樣平均回收率為101.62%，穩(wěn)定性、重復(fù)性好、精密度和準(zhǔn)確度高。

用超聲波輔助法提取桃花中黃酮工藝簡(jiǎn)單，提取率高，根據(jù)直觀分析和方差分析結(jié)果，綜合考慮超聲波輔助法提取桃花中黃酮的最佳工藝條件：乙醇的體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1 g ∶20 mL，超聲時(shí)間60 min，超聲功率80 W。

試驗(yàn)表明，桃花中黃酮含量較高，可以作為提取黃酮的原料之一。通過對(duì)桃花中黃酮提取工藝的探索，既為提取桃花中黃酮積累了經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)又為進(jìn)一步開發(fā)桃花的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值奠定了基礎(chǔ)。

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