王蘭明+劉艷芬+高彥魁

摘要：褐變是影響牡丹石榴離體培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素之一。為減輕牡丹石榴初代培養(yǎng)中的褐變問題，研究基本培養(yǎng)基類型、附加物、光照條件、繼代周期、取材時(shí)間5種因素對(duì)外植體褐變的影響。結(jié)果表明：適宜的基本培養(yǎng)基為1/2MS；黑暗處理對(duì)褐變的影響不明顯；聚乙烯吡咯烷酮對(duì)褐變有明顯的抑制作用，最佳處理濃度為2.0 mg/L；4月下旬取帶芽的半木質(zhì)化莖段為外植體，其褐變程度最輕；取材時(shí)間和轉(zhuǎn)接次數(shù)對(duì)褐變的影響明顯。

關(guān)鍵詞：牡丹石榴；聚乙烯吡咯烷酮；外植體；褐變；因素

中圖分類號(hào)：S665.404+.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0181-03

石榴（Punica granatum）為石榴科石榴屬植物，是我國(guó)重要的果樹和觀賞花木之一。牡丹石榴是近年來選育的新優(yōu)品種，其花朵碩大似牡丹，花期長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月，果大味美，且花果同期同樹，是花果俱佳的珍貴石榴品種[1-2]，頗具推廣價(jià)值。

石榴常規(guī)的扦插、分株等繁殖方法，繁殖速度慢，難以滿足日益增多的種苗需求。目前，已有學(xué)者致力于通過組織培養(yǎng)進(jìn)行石榴快速繁殖的研究[3-5]。但是由于石榴體內(nèi)酚類物質(zhì)含量高，組織培養(yǎng)過程中外植體褐變嚴(yán)重[6-7]，常造成外植體死亡，成為石榴離體培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵制約因素。目前，關(guān)于牡丹石榴離體再生技術(shù)雖然鮮有報(bào)道[8]，但沒有關(guān)于其褐變這一關(guān)鍵問題進(jìn)行報(bào)道和系統(tǒng)研究。本試驗(yàn)以牡丹石榴帶芽莖段為外植體，研究基本培養(yǎng)基、附加物、光照條件、轉(zhuǎn)接次數(shù)、取材時(shí)間5種因素對(duì)外植體褐變的影響，以探討減輕牡丹石榴離體培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的因素條件，為其離體再生體系的建立和規(guī)?；敝程峁┮罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料取自河北工程大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地引進(jìn)的3年生牡丹石榴樹苗。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2014年4月下旬進(jìn)行，以牡丹石榴半木質(zhì)化莖段為外植體，經(jīng)過常規(guī)消毒后，剪切成單芽莖段，接種于各處理培養(yǎng)基，進(jìn)行單因子試驗(yàn)。培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件若無特殊說明，蔗糖含量均為30 g/L，瓊脂含量均為5.5 g/L，pH值5.8，培養(yǎng)溫度25 ℃，光照時(shí)間16 h/d，光照度2 500 lx。接種1周后統(tǒng)計(jì)各處理的褐變率和褐變系數(shù)，5周后統(tǒng)計(jì)褐變死亡率、萌芽率、腋芽生長(zhǎng)狀況。

相應(yīng)計(jì)算公式：外植體污染率=污染的外植體總數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%；褐變率=存活的褐變總數(shù)/存活的外植體總數(shù)×100%；存活率=存活的外植體總數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%；褐變指數(shù)=（∑褐變級(jí)數(shù)×該級(jí)個(gè)數(shù)×100）/（褐變總數(shù)×最高級(jí)級(jí)數(shù)）。褐變級(jí)數(shù)：0級(jí)，莖段基部褐色物質(zhì)滲出不明顯，5周后腋芽正常萌動(dòng)；1級(jí)，莖段基部有少量淡褐色物質(zhì)滲出，5周后腋芽正常萌動(dòng)；2級(jí)，莖段基部褐色物質(zhì)擴(kuò)散至莖段直徑的1～2倍，5周后莖芽萌動(dòng)緩慢；3級(jí)，深褐色物直徑擴(kuò)散至莖段直徑的2倍以上，莖段部分變黑褐色，腋芽不萌動(dòng)；4級(jí)，莖段基部有大量褐色物質(zhì)滲出，5周后腋芽、莖段變黑死亡。

1.2.1 基本培養(yǎng)基的確定 2014年4月中旬，將表面滅菌的外植體接種于MS、1/2MS、1/3MS、1/4MS 4種含有不同濃度無機(jī)鹽的基本培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基均添加0.5 mg/L6-BA、0.1 mg/L IBA。每個(gè)處理接種8～10瓶，每瓶接種2個(gè)外植體。重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析。

1.2.2 光照條件的確定 2014年4月中旬，將外植體表面滅菌后接種于MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基中，光照條件共設(shè)3個(gè)處理，分別為黑暗、光照時(shí)間16 h/d、全光照。每個(gè)處理接種12～13瓶，每瓶接種2個(gè)外植體。

1.2.3 附加物濃度的確定 2014年4月下旬，附加物聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，簡(jiǎn)稱PVP）共設(shè)5個(gè)處理，每個(gè)處理接種8～10瓶，每瓶接種2個(gè)外植體，重復(fù)3次。數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析。各處理配方：處理1，1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA；處理2，1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+1.0 g/L PVP；處理3，1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+2.0 g/L PVP；處理4，1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+3.0 g/L PVP；處理5，外植體用含4.0 mg/L PVP無菌溶液浸泡5 min后接入處理1培養(yǎng)。

1.2.4 不同取材時(shí)期和轉(zhuǎn)接次數(shù)的確定 分別于2014年4月下旬、5月下旬、6月下旬、7月下旬、8月下旬5個(gè)不同時(shí)期進(jìn)行取材接種，將外植體表面滅菌后接種于1/2MS+0.5 mg/L6-BA+0.1 mg/L IBA+2.0 g/L PVP培養(yǎng)基上。每個(gè)處理接種12～13瓶，每瓶接種2個(gè)外植體。以2 d為繼代周期，分別統(tǒng)計(jì)各取材時(shí)期不再發(fā)生褐變所需的轉(zhuǎn)接次數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基對(duì)外植體褐變的影響

由表1可見，在MS、1/2MS、1/3MS、1/4MS 4種基本培養(yǎng)基上，褐變發(fā)生率均為100.0%，但褐變指數(shù)、褐變死亡率以及萌芽率、腋芽生長(zhǎng)狀態(tài)不盡相同；MS培養(yǎng)基與1/2MS、1/3MS、1/4MS培養(yǎng)基的褐變指數(shù)、褐變死亡率和萌芽率均有顯著差異，說明無機(jī)鹽含量對(duì)褐變程度有明顯影響；雖然MS、1/2MS、1/3MS、1/4MS培養(yǎng)基的褐變程度呈逐漸減輕的趨勢(shì)，但是接種5周后，1/3MS、1/4MS培養(yǎng)基上的新葉較小，可能是無機(jī)鹽含量低造成的。因此，選擇1/2MS作為基本培養(yǎng)基，既可以減輕褐變程度，又不影響腋芽的生長(zhǎng)。

2.2 光照條件對(duì)外植體褐變的影響

由表2可以看出，外植體在3種光照條件下的褐變程度均較嚴(yán)重，褐變率依然均為100%；雖然褐變指數(shù)有逐漸減小的趨勢(shì)，但是3個(gè)處理間整體變化與褐變死亡率、萌芽率均無明顯差異。結(jié)果表明，僅黑暗處理對(duì)于減輕牡丹石榴外植體褐變的效果并不明顯。

2.3 附加物對(duì)外植體褐變的影響

由表3可見：添加不同濃度PVP的褐變指數(shù)、褐變死亡率均顯著低于不加PVP（對(duì)照）的處理；其中2.0、3.0 mg/L PVP的處理效果最好，但是后者萌發(fā)的新芽平均長(zhǎng)度和新葉數(shù)均低于前者；4.0 mg/L PVP溶液浸泡的褐變率與對(duì)照相同，依然為100%，雖然褐變指數(shù)、褐變死亡率、萌芽率與對(duì)照相比均差異顯著，但是仍然顯著高于2.0、3.0 mg/L PVP的效果。因此可見，1/2MS+0.5 mg/L 6-BA +0.1 mg/L IBA +2.0 mg/L PVP為減輕牡丹石榴外植體褐變最有效的培養(yǎng)方法。

2.4 不同取材時(shí)期和轉(zhuǎn)接繼代次數(shù)對(duì)外植體褐變的影響

取材時(shí)間對(duì)外植體的褐變率、褐變指數(shù)、褐變死亡率以及萌芽率均有明顯影響，嚴(yán)重時(shí)甚至可導(dǎo)致外植體全部死亡。在生長(zhǎng)季枝條半木質(zhì)化后，取材時(shí)間越早，褐變?cè)捷p。由表4可以看出，4月下旬接種的外植體褐變指數(shù)最小，為18.8%，褐變死亡率為0，萌芽率可達(dá)89.7%；而隨著取材時(shí)間的推移，褐變程度明顯加重，雖然培養(yǎng)基中2.0 mg/L PVP為附加物，但是6月下旬開始，外植體褐變發(fā)生率已達(dá)100%；8月下旬取材時(shí)外植體的褐變死亡率已達(dá)84.7%，萌芽率為0。

轉(zhuǎn)接繼代對(duì)于保證外植體的成活有明顯的作用。在添加2.0 mg/L PVP的培養(yǎng)基上，4月下旬取材時(shí)，不需要轉(zhuǎn)接，外植體就能正常萌芽。5月下旬時(shí)，需要2 d后轉(zhuǎn)接1次，即可抑制褐變的發(fā)生。以后需要多次轉(zhuǎn)接，才能保證外植體的成活。而8月下旬取材時(shí)，褐變死亡率高達(dá)84.7%，雖然有個(gè)別外植體成活，但5周后由于褐變嚴(yán)重，沒有萌芽。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

牡丹石榴組培過程中，外植體褐變嚴(yán)重。本試驗(yàn)表明，無機(jī)鹽濃度、PVP附加物對(duì)減輕褐變有明顯效果，1/2MS無機(jī)鹽濃度、2.0 mg/L PVP附加物可作為最適培養(yǎng)基成分。暗處理對(duì)褐變影響效果不明顯。取材時(shí)間對(duì)外植體褐變程度影響極大，河北省中南部4月下旬為最佳的取材時(shí)期。多次轉(zhuǎn)接可以起到較好的減輕褐變、保證外植體成活的效果。

3.2 討論

植物組織培養(yǎng)過程中，外植體的褐變時(shí)有發(fā)生。尤其是木本植物與單寧、酚類物質(zhì)含量高的植物，如板栗[9]、核桃[10]、黃連木[11]等，褐變程度尤其明顯，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致外植體死亡。除外植體基因型外，褐變程度還受取材時(shí)期、外植體類型、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件等多種因素的影響。

降低無機(jī)鹽濃度對(duì)于減輕褐變的發(fā)生有較好的作用。但無機(jī)鹽濃度過低，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)影響外植體的正常生長(zhǎng)。培養(yǎng)基中附加不同濃度的抗氧化劑、吸附劑均能有效抑制褐變的發(fā)生，但植物材料不同，附加物種類和濃度會(huì)有差別。王菲等在三白石榴[6]、王立婭等在蝴蝶蘭的研究[12]中，均認(rèn)為PVP對(duì)減輕褐變有較好的效果。而有些研究認(rèn)為，活性炭抑制蝴蝶蘭褐變的效果優(yōu)于PVP。由此可見，植物組織培養(yǎng)中，加入酚類物質(zhì)的吸附劑PVP對(duì)于減輕外植體的褐變?nèi)詻]有一定的規(guī)律，其抑制褐變的機(jī)制還須進(jìn)一步研究。

一般認(rèn)為，暗培養(yǎng)由于可以抑制光誘導(dǎo)的多酚氧化酶的活性，因此可以減輕褐變的發(fā)生。這在減輕蝴蝶蘭的褐變程度[12]，延緩黃連木[11]、沙棘[13]的褐變時(shí)間方面均有報(bào)道。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)對(duì)褐變程度的減輕或延緩均沒有明顯作用，推測(cè)牡丹石榴褐變的發(fā)生過程除與多酚氧化酶相關(guān)外，可能還有不受光誘導(dǎo)的其他酶的參與，這一機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)表明，取材時(shí)期對(duì)褐變程度有明顯影響，褐變程度最輕的取材時(shí)期為4月下旬半木質(zhì)化的枝條，這與在紫葉黃櫨[14]、牡丹[15]研究中的報(bào)道一致。這可能與不同生長(zhǎng)時(shí)期植物體內(nèi)酚類物質(zhì)含量不同有關(guān)。枝條生長(zhǎng)早期，牡丹石榴體內(nèi)酚類物質(zhì)的含量較低，隨著生長(zhǎng)的繼續(xù)，酚類物質(zhì)含量逐漸增高，褐化日趨嚴(yán)重。

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