何碧珠+楊超+朱萍+蔣繼宏

摘要：采用秋水仙素溶液浸泡法、涂抹法、加入培養(yǎng)基法誘導金線蓮多倍體，研究不同秋水仙素濃度、處理時間、處理方式金線蓮多倍體的誘導效果，并將誘變植株進行繁殖。結果表明：以700 mg/L秋水仙素加入培養(yǎng)基處理15 h誘變率最高，達53.00%；以500 mg/L浸泡法處理24 h，誘導效果最佳，誘變率為51.67%；以700 mg/L涂抹法涂抹在金線蓮莖節(jié)處誘導效果較好，誘變率為35.00%；3種多倍體誘導的效果順序為加入培養(yǎng)基法>浸泡法>涂抹法。

關鍵詞：金線蓮；多倍體；秋水仙素；誘變率

中圖分類號： S567.23+9.043 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0070-05

金線蓮（Anoectochilus roxburghii）是我國傳統(tǒng)珍貴藥材，屬蘭科（Orchidaceae）開唇蘭屬（Anoectochilus）植物[1]。由于人為掠奪性采挖，金線蓮生境遭受嚴重破壞，加上金線蓮自身繁殖特性，種子細小，發(fā)育不完全，自然狀態(tài)下萌發(fā)率和繁殖率低下等特點，野生金線蓮存量已越來越少[2-5]。多倍體植物具有營養(yǎng)器官大、抗逆性強、藥用活性成分含量高等特性[6]。金線蓮組織培養(yǎng)方面報道雖多[7-13]，但尚未見將一次性成苗培養(yǎng)技術應用于多倍體植株誘導方面應用的報道。本研究運用秋水仙素對一次性成苗培養(yǎng)植株進行多倍體誘導，以期為多倍體金線蓮工廠化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

將在福建省永泰藤山自然保護區(qū)赤壁景區(qū)內采集的野生苗一次性成苗培養(yǎng)的第二代瓶苗作為試驗材料，選擇生長一致、莖部粗壯的植株進行試驗處理。

1.2 方法

采用3種方法進行多倍體誘導試驗，每種方法均設置若干組處理時間和濃度梯度，研究不同取材部位（莖段、莖尖）、處理方法、秋水仙素濃度及處理時間對多倍體誘變率的影響。

1.2.1 秋水仙素溶液浸泡法 選取生長一致、莖節(jié)粗壯組培瓶苗，在無菌條件下將瓶苗植株切成長1～2 cm的帶節(jié)莖段，放入經過高壓滅菌濃度為300、500、700 mg/L的秋水仙素溶液分別浸泡10、20、30、40、50、60 h，每個處理重復3次，以無菌水浸泡處理材料為對照（CK）。將各處理后材料在超凈工作臺上用無菌水沖3～4遍后，接種在一次性成苗培養(yǎng)基MS+1 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+150 g/L土豆+3%蔗糖+0.65%瓊脂+0.2%活性炭上培養(yǎng)，將莖節(jié)和頂芽分開培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度（23±2） ℃，光照強度1 000～1 500 lx，光照時間10 h/d。每瓶接種4個莖段或4個頂芽，每個處理接種5瓶，每個處理重復3次。

1.2.2 培養(yǎng)基添加 選取生長一致、莖節(jié)粗壯組培瓶苗，在無菌條件下將瓶苗切成長1～2 cm的帶節(jié)莖段，接種到分別添加300、500、700 mg/L秋水仙素溶液的上述一次性成苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)的植株，培養(yǎng)時間分別為5、10、15、20、25、30 d，以不加秋水仙素培養(yǎng)基為對照（CK），將處理后的材料轉入不含秋水仙素的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，將莖節(jié)和頂芽分開培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同“1.2.1”節(jié)。每瓶接種4個莖段或4個頂芽，每個處理接種5瓶、重復3次。

1.2.3 秋水仙素蘸在材料處 選取生長一致、莖節(jié)粗壯組培瓶苗，在無菌條件下將瓶苗切成長1～2 cm的帶節(jié)莖段，在超凈工作臺中用無菌棉簽蘸上經高壓滅菌的秋水仙素溶液，涂抹在莖節(jié)處，再將涂抹過秋水仙素的材料接種到“1.2.1”節(jié)所述一次性成苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)的植株，將莖節(jié)和頂芽分開培養(yǎng)，秋水仙素溶液濃度分別為300、500、700 mg/L，共3個處理。每瓶接種4個莖段或4個頂芽，每個處理接種5瓶、重復3次，以無菌水處理材料為對照（CK）。

1.3 多倍體鑒定

1.3.1 形態(tài)學觀察 從植株大小以及葉片大小、顏色、厚度等形態(tài)特征上比較經過秋水仙素處理的植株與對照植株的差異，從而初步篩選出誘導植株。分別測量培養(yǎng)3、5個月二倍體苗和四倍體苗葉長、葉寬、葉厚、莖直徑、株高。

選擇生長一致的誘導植株和對照植株，分別撕取葉片下表皮，置于載玻片上制成臨時裝片，在日本產Olympus倒置式生物顯微鏡下觀察。在10×10倍鏡下，隨機選擇10個視野，計算每個視野中的氣孔數目；在10×40倍鏡下，隨機選擇10個視野，測量視野中的氣孔長度、寬度。

1.3.2 染色體觀察 對外部形態(tài)和氣孔明顯變大的植株，采用改良苯酚品紅染色法進行根尖染色體鑒定。在08：00—10：00切取植株根尖，先置于4 ℃冰箱中預處理8 h，后用卡諾固定液（冰乙酸 ∶乙醇=1 ∶3，V ∶V）在室溫下固定18 h，蒸餾水漂洗2～3次后，用90%、80%、70%乙醇溶液各浸泡30 min，再用蒸餾水漂洗2～3次，用1 mol/L HCl溶液在60 ℃ 水浴中解離處理30 min，解離好的根尖用蒸餾水洗凈并吸干水分，用改良苯酚品紅溶液染色5 min壓片，將壓片置于顯微鏡下鏡檢觀察染色條數。

2 結果與分析

2.1 金線蓮多倍體誘導研究

2.1.1 浸泡處理對金線蓮多倍體離體誘導效果 不同濃度秋水仙素溶液浸泡處理后培養(yǎng)1個月時，莖節(jié)處未出現(xiàn)芽萌動現(xiàn)象，頂芽沒有伸長生長。培養(yǎng)2個月后，40%莖節(jié)間開始膨脹，腋芽發(fā)白，逐漸突起并伸長，抽出主芽，隨后分化出二級、三級側芽；5%生長出畸形芽；一部分出現(xiàn)褐化現(xiàn)象；一部分出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象；一部分剛開始有芽分化出來，隨后逐漸萎蔫死亡。與對照相比，處理2、12 h對材料抑制作用不明顯，芽長勢好，側芽多，部分處理長出叢生芽；處理24、36、48、60 h對材料生長抑制作用明顯，莖段芽萌動緩慢，生長慢，側芽較少。

比較秋水仙素溶液對莖節(jié)、頂芽生長的影響，莖節(jié)較頂芽容易分化出側芽，頂芽未分化出芽，主要表現(xiàn)為伸長生長，生長較快。試驗發(fā)現(xiàn)，秋水仙素對頂芽毒害作用比對莖節(jié)嚴重，頂芽生長受到明顯抑制，頂芽膨大后，部分生長停止并逐漸死亡，相同秋水仙素溶液濃度、相同處理時間下，頂芽成活率明顯低于莖節(jié)（圖1）。

由表1可知，材料成活率隨著秋水仙素溶液濃度升高、處理時間延長而逐漸降低，尤其以700 mg/L秋水仙素溶液處理60 h下，材料成活率最低，僅為13.33%。相同秋水仙素濃度下，隨著處理時間延長，材料成活率也逐漸降低，300 mg/L秋水仙素溶液處理2 h下材料成活率為96.67%，而處理60 h時材料成活率降至35.00%；500 mg/L秋水仙素溶液處理2 h下材料成活率為93.33%，而處理60 h時材料成活率降至25.00%；700 mg/L秋水仙素溶液處理2 h下材料成活率為88.33%，而處理60 h時材料成活率降至13.33%。相同處理時間下，隨著秋水仙素溶液濃度升高，材料成活率顯著降低。

由表1可知，不同濃度秋水仙素溶液處理不同時間后，對四倍體誘變率的影響有顯著差異。在相同秋水仙素濃度下，隨著處理時間延長，四倍體誘變率先升高后降低。300 mg/L秋水仙素溶液處理2 h，誘變率為0%，而其他時間處理下誘變率為3.33%～48.33%，尤其是處理36 h下誘變率最高，為48.33%。500 mg/L秋水仙素溶液處理2 h，誘變率為0%，而其他時間處理下誘變率為8.33%～51.67%，尤其是處理24 h 下誘變率最高，為51.67%。700 mg/L秋水仙素溶液處理下誘變率為8.33%～50.00%，尤其是處理12 h下誘變率最高，為50.00%。秋水仙素對試驗材料有一定傷害，隨著秋水仙素濃度升高和處理時間延長，傷害程度加重，導致死亡率升高，因此四倍體誘變率反而降低。

2.1.2 加入培養(yǎng)基法對多倍體離體誘導的效果 與對照相比，處理5 d對材料抑制作用不明顯，芽長勢好，側芽多，部分長出叢生芽；處理10～30 d對材料生長抑制作用明顯，莖段萌動緩慢，側芽較少，頂芽生長慢。

將秋水仙素加入培養(yǎng)基中對莖節(jié)和頂芽生長產生一定影響，莖節(jié)較頂芽容易分化出側芽，頂芽未分化出芽，主要表現(xiàn)為伸長生長，生長較快。觀察發(fā)現(xiàn)，將秋水仙素加入培養(yǎng)基中對莖段毒害作用比對頂芽嚴重，莖段萌動受到明顯抑制，部分不萌動并逐漸死亡，相同秋水仙素濃度、處理時間下，莖段成活率明顯降低，這與浸泡處理結果相反。

由表2可知，將材料接種到加入不同濃度秋水仙素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間對材料死亡率產生影響。隨著秋水仙素溶液濃度升高、培養(yǎng)時間延長，材料死亡率隨之升高，尤其以700 mg/L 秋水仙素處理30 d，材料死亡率最高，為80.00%。低濃度秋水仙素下，延長處理時間，材料死亡率保持在相對較低水平；高濃度秋水仙素下，延長處理時間，材料死亡率升高很快。

由表2還可知，低濃度秋水仙素下，延長處理時間，誘變率沒有明顯增加；高濃度秋水仙素下，延長處理時間，誘變率先升高后降低。300 mg/L秋水仙素溶液處理5～30 d，誘變率為0%～13.33%；而700 mg/L秋水仙素溶液處理5～30 d，誘變率從8.33%上升至53.33%后，又降至15.00%。秋水仙素對材料有一定傷害，隨著濃度升高和處理時間延長，傷害程度加重，導致死亡率升高，因此四倍體誘變率反而降低。

2.1.3 涂抹法對多倍體離體誘導效果的影響 涂抹法較浸泡法、加入培養(yǎng)基法對材料傷害作用較輕，且節(jié)約藥品，但對四倍體誘導效果明顯較差。由表3可見，秋水仙素濃度為300 mg/L時，四倍體誘變率為13.33%，隨著秋水仙素濃度升高誘變率逐漸增加，當秋水仙素濃度為700 mg/L時，誘變率為35.00%，誘導效果明顯不如浸泡法、加入培養(yǎng)基法，因此該方法不適用于金線蓮多倍體誘導。

2.2 誘導植株形態(tài)學觀察

與對照相比，處理組植株在株高、莖粗、葉片大小、葉片厚度、莖節(jié)等外部形態(tài)特征上發(fā)生明顯變化。對莖段處理后，前期誘導分化慢，營養(yǎng)器官明顯增大，主要表現(xiàn)在植株高大，莖稈粗壯，莖節(jié)明顯且長，葉片肥厚，葉片變小，葉脈金色加深等，與二倍體差異明顯（表4）。

氣孔大小、氣孔密度及保衛(wèi)細胞大小等可作為鑒定多倍體與二倍體的間接指標[14-17]。鏡檢發(fā)現(xiàn)，誘導植株氣孔明顯增大，氣孔長度、寬度均明顯大于對照植株（圖2-a至圖2-d）。由表5可見，誘導植株氣孔為44.64 μm×27.78 μm，對照植株氣孔為32.24 μm×17.36 μm，誘導植株氣孔長度、寬度分別比正常植株增加38.46%、37.51%。每個視野氣孔數量明顯少于對照植株，為對照植株的53.85%。

2.3 誘導植株根尖染色體數目觀察

從形態(tài)學和解剖學上初步篩選出誘導植株，進行根尖染色體鑒定。曾雅娟等研究表明，金線蓮染色體數目為2n=40[18]。對誘導植株和對照植株進行根尖染色體制片（圖2-e、圖2-f），由于金線蓮染色體數目較多，染色體出現(xiàn)重疊，未能清晰算出染色體數目，但可以明顯看出誘導植株根尖細胞體積變大，細胞核增大，部分細胞形態(tài)發(fā)生變化，染色體數目增多。

3 結論與討論

將化學誘導劑和組織培養(yǎng)技術相結合進行人工誘導多倍體，已經在許多植物上取得成功。以往研究表明，掌握秋水仙素濃度及處理時間是多倍體誘導成功的關鍵[19-21]。秋水仙素濃度太低或處理時間太短無法達到誘導目的；而秋水仙素濃度過高或處理時間太長，雖能達到誘導效果，但植株受傷害嚴重，死亡率高。秋水仙素誘導處理方法有浸泡法、涂抹法、注射法、加入培養(yǎng)基等方法，在實際操作中常需要根據植物材料和部位選擇適宜的處理方法。

本研究采用浸泡、涂抹、加入培養(yǎng)基等3種方法來誘導多倍體。其中浸泡法以500 mg/L秋水仙素溶液處理24 h下誘導效果最佳，誘變率為51.67%，這與蔡文燕等的研究結果略有差異，蔡文燕等用0.1%、0.2%的秋水仙素溶液浸泡，結果表明，用0.1%秋水仙素浸泡48 h條件下，誘導效果最好，誘變率為48%[22]。這說明相同處理方法下，秋水仙素濃度不同，誘導效果也會不同，誘導效果還與培養(yǎng)時間、培養(yǎng)方法有關，金線蓮品種差異、取材部位與時間不同等都會影響試驗結果。在秋水仙素加入培養(yǎng)基試驗中，以700 mg/L秋水仙素處理15 d誘變率最高，達53%。王麗芳等用300 mg/L秋水仙素處理金線蓮莖段、頂芽3～19 d，結果表明處理13 d的加倍效果最好，加倍率為72%[23]；而本研究中用300 mg/L秋水仙素處理15 d，誘變率僅為5%，這與王麗芳等研究結果不一致。涂抹法中，以700 mg/L秋水仙素涂抹在莖節(jié)的誘導效果較好，誘變率為35%，涂抹法的誘變率較浸泡法、加入培養(yǎng)基法低，但對材料傷害作用較輕，同時也節(jié)省藥品。

秋水仙素處理后外植體前期誘導分化慢，后期生長較快，營養(yǎng)器官明顯增大，表現(xiàn)為植株高大、莖稈粗壯、莖節(jié)多且明顯，葉片變多、變短且肥厚，葉脈金色加深等特點；誘導植株氣孔明顯增大，氣孔長度和寬度均顯著大于對照，其形態(tài)和氣孔特征的誘導與通常的多倍體誘導結果一致[24-26]。

測得組培苗階段二倍體苗、多倍體苗的多糖含量分別從10.13%、14.05%上升到15.91%、18.91%，多倍體瓶苗在大棚栽培6個月后多糖含量為9.69%，而二倍體苗在大棚栽培6個月后多糖含量僅為8.77%，可見在相同栽培環(huán)境下，多倍體植株栽培6個月多糖含量高于二倍體植株。由此可知，多倍體金線蓮的多糖含量高于二倍體植株，得出多倍體苗多糖含量高于二倍體植株，這與多倍體營養(yǎng)成分增加的特點一致，多倍體瓶苗多糖含量高于二倍體瓶苗，這與Olimpienko等研究發(fā)現(xiàn)四倍體鐵皮石斛的可溶性糖含量高于二倍體的研究結果[27]一致。

測得二倍體苗、多倍體苗總黃酮含量分別從1.17%、1.24%上升到1.27%、1.38%。得出多倍體苗總黃酮含量高于二倍體植株，這進一步證明了多倍體營養(yǎng)成分增加的特點，測得大棚栽培6個月的二倍體栽培苗、多倍體栽培苗總黃酮含量分別為1.47%、1.92%，栽培6個月時多倍體植株多糖、總黃酮含量高于二倍體植株（多倍體苗總黃酮含量接近野生苗的1.97倍）。對赤壁金線蓮組培苗和栽培苗進行總黃酮含量的測定，發(fā)現(xiàn)其均含有黃酮類物質，這與曾建軍等研究認為金線蓮組培苗富含黃酮類物質的報道[8]一致。組培苗黃酮含量隨著培養(yǎng)時間延長而增多，移栽后總黃酮含量進一步增加，黃酮是植物體內的次生代謝產物，其含量變化受外界條件影響，如光照刺激等對其合成有幫助[28-29]。將金線蓮移栽到光照等條件較好的外界環(huán)境中，有利于黃酮積累。

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