徐龍鑫+劉鏡+張麟+何光中

摘要：為研究牛血管生成素樣蛋白4（angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4）在調(diào)節(jié)脂肪和能量代謝中的作用，采用DNA測序技術(shù)，對關(guān)嶺黃牛92頭個體ANGPTL4基因的多態(tài)性進行研究，分析多態(tài)性位點與關(guān)嶺黃牛生長性狀的相關(guān)性。結(jié)果表明，在擴增片段為752 bp的產(chǎn)物中，發(fā)現(xiàn)387 C>T、418 C>T、449 A>T等3個突變位點，3個突變位點均處于哈代-溫伯格不平衡狀態(tài)（HWE）（P<0.05），3個多態(tài)位點的多肽信息含量（PIC）均為中度多態(tài)。相關(guān)性檢測結(jié)果表明，418 C>T突變位點不同基因型關(guān)嶺黃牛的體高、體斜長、胸圍、腹圍表現(xiàn)出差異極顯著（P<0.01），449A>T突變位點不同基因型關(guān)嶺黃牛的體高表現(xiàn)出差異顯著（P<0.05），胸圍、腹圍表現(xiàn)出差異極顯著（P<0.01）。

關(guān)鍵詞：關(guān)嶺黃牛；ANGPTL4基因；多態(tài)性；關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號： S823.8+12 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0051-02

血管生成素相關(guān)蛋白4（angiopoietin-related protein 4，ANGPTL4）是與血管生成、脂類代謝、葡萄糖代謝、胰島素敏感性密切相關(guān)的分泌性蛋白質(zhì)因子[1-3]，并與TGFβ信號通道直接關(guān)聯(lián)，在腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用[4]。現(xiàn)有研究表明，類血管生成素4除了在血管發(fā)生方面同血管生成素（ANGPTL）相似的作用外，它還可以抑制脂蛋白脂肪酶的活性同時正調(diào)控血漿甘油三脂水平[5-6]，促進脂肪動員，抑制脂肪貯存[7]。它是調(diào)控脂類分化和葡萄糖代謝動平衡的核受體，因此，ANGPTL4基因可能在脂類代謝和葡萄糖代謝動平衡的調(diào)控方面發(fā)揮作用[8-9]。

目前，在人和鼠上對ANGPTL4基因的研究報道較多，但是家畜該基因的研究報道較少。馬云克隆了牛的ANGPTL4基因的CDS序列和部分DNA序列，運用測序和PCR-SSCP相結(jié)合的方法對該基因的部分基因組DNA片段進行單核苷酸多態(tài)性檢測[10]，同時運用一般線性模式研究ANGPTL4基因與8個品種牛肉質(zhì)性狀的相關(guān)性，結(jié)果表明，牛ANGPTL4基因的遺傳變異與牛育肥后肌內(nèi)脂肪含量存在密切關(guān)系。研究ANGPTL4基因的結(jié)構(gòu)和功能，剖析其影響牛肌間脂肪含量的分子機制，有助于實現(xiàn)肌間脂肪含量性狀的遺傳改良。

本研究采用直接測序方法，以貴州關(guān)嶺黃牛為對象，研究ANGPTL4基因的多態(tài)性，同時與關(guān)嶺黃牛生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析，旨在尋找牛ANGPTL4基因與代謝調(diào)控的關(guān)系，尋找黃牛與生長性狀有關(guān)的分子標記，為貴州黃牛標記輔助育種提供基礎(chǔ)資料，為提高貴州黃牛的生長性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

92頭關(guān)嶺黃牛全血樣采自貴州省關(guān)嶺縣種群核心保種區(qū)。采取的黃牛全血樣肝素抗凝，放入冰盒中帶回實驗室-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩Ｔ诓蓸拥耐瑫r，對各個體的生長性狀、體長數(shù)據(jù)進行測定。

1.2 基因組DNA的提取

采用蛋白酶K和TaKaRa Blood Genome DNA Ex-traction Kit（購于北京天根生物公司）提取基因組DNA。

1.3 引物設計和PCR擴增

根據(jù)在GenBank 中登錄的牛ANGPTL4基因序列（GenBank登錄號為NC 007305.4），使用引物設計軟件PrimerPremier 5.0設計1對引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列信息見表1。

PCR反應體系為20 μL，其中2×Taq PCR Master Mix10 μL，購于北京天根生物公司；上下游引物各1 μL；DNA 模板2 μL；ddH2O 6 μL。PCR 反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR產(chǎn)物的測序

將PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒回收擴增片段，送生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用DNAstart軟件包中的SeqMan對測序所得的序列進行校對，用Clustalx程序進行同源性比對。基因型頻率、等位基因頻率、雜合度等群體遺傳參數(shù)采用Popgene生物技術(shù)軟件處理。運用SPSS 13.0分析生長性能數(shù)據(jù)及關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ANGPTL4基因SNP檢測

由圖1可見，關(guān)嶺黃牛ANGPTL4基因PCR擴增片段長度為752 bp，經(jīng)測序檢測發(fā)現(xiàn)，387 C>T、418 C>T、449 A>T等3個突變位點均存在2種基因型。

2.2 關(guān)嶺黃牛ANGPTL4基因多態(tài)性分析

由表2可見，3個變異位點均是雜合子基因型為優(yōu)勢基因型。387 C>T變異位點C等位基因頻率小于T等位基因，418 C>T變異位點C等位基因頻率大于T等位基因，449A>T變異位點A等位基因頻率大于T等位基因。HWE檢測結(jié)果表明，3個變異位點均處于HWE不平衡狀態(tài)（P<0.05）。3個變異位點的雜合度 （He） 介于0.441 9～0.492 7之間，有效等位基因（Ne）介于1.784 1～1.960 8之間，多態(tài)信息含量（PIC）均呈現(xiàn)中度多態(tài)。

2.3 關(guān)嶺黃牛ANGPTL4基因多態(tài)位點與生長性狀關(guān)聯(lián)性分析

如表3所示，將關(guān)嶺黃牛ANGPTL4基因多態(tài)位點與關(guān)嶺黃牛體高、體斜長、胸圍、腹圍、管圍、十字部高、坐骨端寬 7個生長性狀指標進行關(guān)聯(lián)性分析，418 C>T變異位點CT基因型個體體高、體斜長、胸圍、腹圍極顯著大于CC基因型；449 A>T變異位點AA基因型個體體高顯著大于AT基因型，胸圍、腹圍極顯著大于AT基因型。

3 結(jié)論與討論

候選基因法是一種尋找畜禽重要經(jīng)濟性狀遺傳標記的常用方法，它可以直接研究該基因多態(tài)性與個體經(jīng)濟性狀的關(guān)系。本研究通過測序方法對關(guān)嶺黃牛的ANGPTL4基因進行多態(tài)性分析，并與生長性狀進行關(guān)聯(lián)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個變異位點均具有2種基因型。從進化角度看，群體中的遺傳多樣性是歷史的產(chǎn)物[11]，多態(tài)性信息含量和雜合度都是群體內(nèi)遺傳變異的重要度量指標，雜合度值越大，群體內(nèi)的遺傳變異就越大。多態(tài)信息含量值衡量基因變異程度高低，Botstein等提出衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標，當PIC>0.5 時，該變異位點為高度多態(tài)；當0.25

ANGPTL4蛋白是一種具有廣泛生理功能的物質(zhì)，尤其對脂代謝的調(diào)控具有重要作用，脂代謝影響肉質(zhì)的嫩度、風味和多汁性，脂肪性狀是衡量肉質(zhì)的重要指標之一。因此，研究ANGPTL4基因的突變對對牛生長發(fā)育的影響具有重要的理論和實踐意義。本研究中發(fā)現(xiàn)，418 C>T變異位點CT基因型個體體高、體斜長、胸圍、腹圍極顯著大于CC基因型；449 A>T變異位點AA基因型個體體高顯著大于AT基因型，胸圍、腹圍極顯著大于AT基因型。因此，ANGPTL4基因完全可以作為牛生長性狀的潛在遺傳標記，為貴州黃牛肉用性能分子育種提供理論依據(jù)。

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