●董 貝 袁園園

(濟(jì)南市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 山東 濟(jì)南 250316)

●王建東

(濟(jì)南市長(zhǎng)清區(qū)農(nóng)業(yè)局 山東 濟(jì)南 250399)

●周菡蒂

(濟(jì)南市植物保護(hù)站 山東 濟(jì)南 250021)

蛹蟲草人工栽培關(guān)鍵技術(shù)的研究新進(jìn)展*

●董 貝 袁園園

(濟(jì)南市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 山東 濟(jì)南 250316)

●王建東

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●周菡蒂

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蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)又稱北蟲草，是由蟲草菌侵染寄主昆蟲的幼蟲、成蟲或蛹而形成的昆蟲尸體與真菌子座的復(fù)合體。蛹蟲草主要化學(xué)成分和藥理作用與冬蟲夏草相似，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力的功效，在哮喘及支氣管疾病、腎衰竭病的治療方面有很好的效果。在國(guó)家支持和鼓勵(lì)下，十年來蛹蟲草人工栽培得到很大發(fā)展。本文對(duì)蛹蟲草人工栽培的幾個(gè)關(guān)鍵技術(shù)的研究進(jìn)行了綜述，旨在為我國(guó)蛹蟲草產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展提供支持。

1 蛹蟲草菌種的選育

優(yōu)良菌種對(duì)于蛹蟲草人工栽培至關(guān)重要。通常以菌絲體粗壯、萌發(fā)力強(qiáng)、轉(zhuǎn)色快、出草快且均勻作為外觀指標(biāo)，以蛹蟲草產(chǎn)量、蟲草素、多糖、蟲草酸、腺苷等活性成分含量作為品質(zhì)指標(biāo)。蛹蟲草選育技術(shù)手段多樣，采用雙層平板CR培養(yǎng)基組合，能夠篩選出性狀優(yōu)良、活力高的蛹蟲草純種菌株。采用正交設(shè)計(jì)和雙滅活標(biāo)記方法對(duì)冬蟲夏草與蛹蟲草進(jìn)行原生質(zhì)體融合研究，成功獲得融合子。王寧等以鉤懸法收集蛹蟲草單孢子培養(yǎng)單核菌絲，通過雜交成功培育出生物轉(zhuǎn)化率和蟲草素含量高的新菌株。袁麗麗等通過高壓電暈電場(chǎng)誘變蛹蟲草分生孢子，獲得了幾組與原始菌株拮抗性明顯的誘變菌株。

目前輻射誘變育種研究較多，蛹蟲草菌種經(jīng)過航天搭載后，蟲草素、蟲草酸、腺苷、蟲草多糖等活性成分含量較原始菌株都有明顯的提高。離子束輻射和亞硝基胍復(fù)合誘變能夠成功選育出生長(zhǎng)指標(biāo)較原始菌株有顯著提高的新菌株。張俊濤等采用CO60-r射線在500Gy條件下輻射蛹蟲草菌絲選育的新菌株較原始菌株子實(shí)體明顯增粗，根數(shù)減少，但子實(shí)體的重量與原來的相當(dāng)。

2 蛹蟲草栽培方式

目前蛹蟲草的人工栽培有3種方式：一是當(dāng)前生產(chǎn)規(guī)模最大的以大米、小麥等為主要原料的固體培養(yǎng)基栽培方式，這種方式以培育蛹蟲草子實(shí)體為主；二是液體發(fā)酵方式，主要用于工業(yè)化培育蟲草菌的無(wú)性型菌絲體或用于蟲草素的提??；三是以昆蟲幼蟲或蛹的活體接種蟲草菌培育蟲菌復(fù)合體。

2.1固體培養(yǎng)基栽培

蛹蟲草固體培養(yǎng)基栽培過程包括菌絲體的生長(zhǎng)、子實(shí)體的分化和生長(zhǎng)，與天然蛹蟲草較為接近。這種方式成本低、技術(shù)簡(jiǎn)便，但栽培周期較長(zhǎng)，生理過程的復(fù)雜性使得其對(duì)栽培環(huán)境的調(diào)控要求非常嚴(yán)格。培養(yǎng)基原料以大米、小麥為主，麥粒培養(yǎng)基較大米培養(yǎng)基更適合蛹蟲草的生長(zhǎng)，麥粒與營(yíng)養(yǎng)液比例為1∶1.6時(shí)蛹蟲草出草快、產(chǎn)量高。在培養(yǎng)基pH為6.0、培養(yǎng)溫度為20℃的條件下最適合菌絲生長(zhǎng)，在培養(yǎng)基pH為5.0、培養(yǎng)溫度為26℃的條件下最適合蟲草素積累。每天光照16小時(shí)，菌絲體轉(zhuǎn)色及原基形成效果好；每天光照12小時(shí)，子實(shí)體質(zhì)量好且產(chǎn)量高。王玉和劉曉蘭對(duì)蛹蟲草菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖溶酶的適合培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化后，其纖溶酶活力達(dá)167±1U/mL。

2.2液體發(fā)酵培養(yǎng)

與固體栽培方式相比，液體發(fā)酵培養(yǎng)方式菌絲體產(chǎn)量大，栽培條件簡(jiǎn)單易控，有利于大量提取與天然蛹蟲草有效藥用成分相似的化學(xué)物質(zhì)。但經(jīng)過液體發(fā)酵培養(yǎng)后的蛹蟲草菌絲體需及時(shí)加工或接種，繼續(xù)保存難度大。液體發(fā)酵培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)的研究主要集中在接種量的控制及培養(yǎng)條件的優(yōu)化方面。接種孢子數(shù)在1.5×1010時(shí)制作的母種最適合用于蛹蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)菌絲體和蟲草菌素。蛹蟲草菌絲體生長(zhǎng)最適碳源為葡萄糖和蔗糖，最適氮源為蛋白胨和檸檬酸銨，產(chǎn)蟲草素的最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為牛肉膏。pH 6～7、溫度20～25℃的培養(yǎng)條件最適宜菌絲體生長(zhǎng)。秦鵬等對(duì)蛹蟲草液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，使得菌絲體產(chǎn)率比初始培養(yǎng)基增加了1.73倍，蟲草素積累量比初始培養(yǎng)基中增加了1.56倍。狄志彪等研究表明發(fā)酵液與菌絲體中蟲草素的質(zhì)量比約為97∶3，改變培養(yǎng)基的種類不會(huì)影響總蟲草素在發(fā)酵液與菌絲體中的分配比。

2.3昆蟲活體人工栽培

蛹蟲草活體人工栽培可獲得與天然蛹蟲草子實(shí)體最為相似的產(chǎn)品。1986年我國(guó)首次成功通過在蠶體上人工接種蛹蟲草菌獲得了與天然蛹蟲草子座相一致的菌蟲復(fù)合體。經(jīng)過多年的發(fā)展，目前的活體接種方法有喂食法、噴灑法、注射法和穿刺法等。孟楠等用柞蠶5齡幼蟲，采用液體菌液針頭平行蠶體表注射的方法，在常規(guī)條件下培養(yǎng)，感染硬化時(shí)間短，可達(dá)到批量生產(chǎn)的規(guī)模。涂道勇發(fā)明了一種使蟲草子實(shí)體與冬蟲夏草一樣從桑蠶蛹蟲體的頭部或尾部出草的新技術(shù)。李亞潔等以蓖麻蠶蛹為寄主，采用液體菌種注射大大提高僵化率和出草率。蛹蟲草活體培育成本高，條件要求嚴(yán)格，目前仍未實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)。

3 添加劑對(duì)人工栽培蛹蟲草的作用

目前有關(guān)蛹蟲草人工栽培添加劑的研究主要集中在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、昆蟲激素以及其他在食用菌栽培中使用過的添加劑上。玉米素和吲哚乙酸能夠提高蟲草多糖含量，加快子座生長(zhǎng)。環(huán)磷酸腺苷可以增加鮮重，激動(dòng)素則對(duì)干重提高有顯著作用。赤霉素和2，4-二氯苯氧乙酸能夠促進(jìn)蛹蟲草菌絲體生長(zhǎng)，萘乙酸則減慢了菌絲體的生長(zhǎng)速率，但適量的萘乙酸能更好地促進(jìn)蟲草菌素的積累。在培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)液中加入2，4-二氯苯氧乙酸和檸檬酸三胺可縮短蛹蟲草的生長(zhǎng)周期，提高蟲草素含量，加入秋水仙素和鏈霉素可誘導(dǎo)原基分化，增強(qiáng)培養(yǎng)基的抑菌能力，提高蟲草子實(shí)體蟲草素的含量。濃度為1mg/L三十烷醇能促進(jìn)蛹蟲草生長(zhǎng)。房海珍研究了幾種新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作為添加劑對(duì)蛹蟲草CM-16生長(zhǎng)發(fā)育的影響。低濃度的殼寡糖能夠提高蛹蟲草子座產(chǎn)量和品質(zhì)，縮短周期；濃度為0.01mg/L的復(fù)硝酚鈉對(duì)菌絲生長(zhǎng)最為有利，以3～5mg/L濃度范圍內(nèi)能夠加快子座對(duì)氮源和碳源的吸收利用，提高產(chǎn)量，同時(shí)使超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和丙二醛3種酶活性均達(dá)到最高；低濃度的四甲基戊二酸能夠刺激子座生長(zhǎng)；胺鮮酯在1～3mg/L的濃度范圍內(nèi)，子座的超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性、鮮質(zhì)量和基質(zhì)利用率等均優(yōu)于4～6mg/L的濃度范圍；氯吡脲在5.0mg/L的濃度時(shí)對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)發(fā)育最為有利。

4 蛹蟲草菌種退化問題

解決菌種退化是蛹蟲草人工栽培生產(chǎn)中的核心技術(shù)難題，退化使得蛹蟲草產(chǎn)量和品質(zhì)都受到影響。蛹蟲草菌種退化涉及了一系列復(fù)雜的生化、生理及遺傳的過程。

4.1菌種退化的原因

目前關(guān)于蛹蟲草菌種退化的原因，有基因的突變、核型改變、活性氧的積累及營(yíng)養(yǎng)供給不足等眾多說法。李美娜等研究發(fā)現(xiàn)，退化菌株較野生馴化菌株在DNA水平上發(fā)生了頻率較高的突變。汪虹等通過引物PCR鑒定發(fā)現(xiàn)，正常菌株含有兩類交配型基因，退化菌株僅僅含有一類交配型基因，推測(cè)蛹蟲草發(fā)生不形成子實(shí)體的原因之一是核相發(fā)生了改變，即異核體變成了同核體。鄭壯麗研究發(fā)現(xiàn)退化菌株菌絲體內(nèi)含有較多活性氧和較高水平的氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激使機(jī)體處于易損狀態(tài)，同時(shí)能增強(qiáng)致病因素的毒性作用，可導(dǎo)致基因突變。熊承慧將來源于構(gòu)巢曲霉的谷胱甘肽過氧化物酶基因轉(zhuǎn)化到蛹蟲草菌株中進(jìn)行過量表達(dá)，消除了蛹蟲草菌種退化的現(xiàn)象。李義勇等研究認(rèn)為，蛹蟲草菌種退化主要原因之一是營(yíng)養(yǎng)供給不能滿足菌體生長(zhǎng)要求，以酵母制品為主組分的復(fù)合氮源培養(yǎng)基型經(jīng)優(yōu)化后，經(jīng)過3次傳代后發(fā)酵穩(wěn)定性保持良好，未出現(xiàn)菌種退化現(xiàn)象。

4.2退化菌種的鑒定

蛹蟲草退化的現(xiàn)象在栽培時(shí)才體現(xiàn)出來，在生產(chǎn)上常造成資源的浪費(fèi)，因此對(duì)蛹蟲草退化菌種的早期檢測(cè)的研究就顯得尤為重要。退化菌株在菌絲體階段的外部形態(tài)能通過鏡檢區(qū)分，正常菌株在見光后漸變?yōu)殚冱S色，菌絲粗壯、挺立，分生孢子呈念珠狀；退化菌株的菌絲體見光后不變色，菌絲纖細(xì)、彎曲，孢子粘連在一起呈頭狀。通過氯化三苯基四氮唑的氧化還原反應(yīng)對(duì)脫氫酶的測(cè)定可提早淘汰退化菌株。在蛹蟲草孢子培養(yǎng)基中添加指示劑溴麝香草酚藍(lán)進(jìn)行培養(yǎng)，以孢子培養(yǎng)液的顏色變化或脫色率為指標(biāo)，能快速鑒定蛹蟲草退化菌種。

4.3推遲菌種退化的方法

適宜的保藏和培養(yǎng)條件及減少菌種轉(zhuǎn)管次數(shù)能有效延遲菌種退化，子囊孢子分離法和蠶蛹回接法能有效對(duì)菌種進(jìn)行復(fù)壯。蛹蟲草菌種在4℃恒溫保存，保藏培養(yǎng)基加0.5%的瓊脂，用無(wú)菌膠塞代替棉塞，且每半年活化一次有利于延長(zhǎng)菌種保藏時(shí)間。左雪枝研究發(fā)現(xiàn)組織分離法更適合遺傳和保持母本性狀，子囊單孢子配對(duì)法更適合篩選更優(yōu)菌株。

5 病蟲害防治

在蛹蟲草人工栽培過程中常有病蟲害發(fā)生，病原物主要有細(xì)菌、真菌、螨、蚊、蠅及跳蟲等。發(fā)生病害，常造成培養(yǎng)基變質(zhì)，菌絲體不能正常生長(zhǎng)。害蟲以取食菌絲或子實(shí)體為主，螨不僅直接取食菌絲、蛀食培養(yǎng)料，而且攜帶并傳播病源雜菌。蚊蠅以幼蟲取食培養(yǎng)料和菌絲，從而影響菌種定植蔓延，造成發(fā)菌困難。

蛹蟲草病蟲害防治應(yīng)遵循預(yù)防為主、防治結(jié)合的綜合防治措施。認(rèn)真做好環(huán)境場(chǎng)所和栽培各環(huán)節(jié)的清潔消毒工作，發(fā)現(xiàn)污染應(yīng)及時(shí)清除污染源，防止蔓延；當(dāng)子實(shí)體成熟時(shí)應(yīng)及時(shí)采收，避免病蟲害的發(fā)生。溫度低于24℃、濕度在75%～80%、pH在7.0～7.5范圍內(nèi)，可有效抑制致病深綠木霉的發(fā)生。1000倍液的辛硫磷加殺螨劑防治螨類效果較好。以大米、蠶蛹粉、蛋白胨等作培養(yǎng)基，加上適當(dāng)?shù)牧姿岫溻?、硫酸鎂、VB等可提高蛹蟲草的抗病蟲能力。

6 問題與展望

目前，我國(guó)蛹蟲草人工栽培雖已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但在一些關(guān)鍵環(huán)節(jié)上仍存在問題。一是由于蛹蟲草菌種易退化，加之各地栽培方法的差異，蛹蟲草的品質(zhì)存在不穩(wěn)定性，缺乏統(tǒng)一指標(biāo)；二是在人工栽培蛹蟲草的過程中添加劑的使用劑量問題，食用和藥用安全性難以得到保障；三是目前蛹蟲草人工栽培缺少專業(yè)的發(fā)酵設(shè)備。蛹蟲草菌絲體液體發(fā)酵后期粘度大、耗能高，普通的生物發(fā)酵罐難以滿足需要，要保證整個(gè)生長(zhǎng)周期不被污染，需要研發(fā)專門的設(shè)備。

人工栽培的蛹蟲草作為冬蟲夏草的替代產(chǎn)品，有著很高的保健和醫(yī)用價(jià)值，市場(chǎng)潛力巨大。但是蛹蟲草菌種退化問題一直是阻礙蛹蟲草人工栽培的一大瓶頸，關(guān)于蛹蟲草生長(zhǎng)代謝等相關(guān)基因和蛋白的研究有助于揭示蛹蟲草菌種退化機(jī)理，對(duì)蛹蟲草活性成分的挖掘有著深層意義，進(jìn)而選育出高產(chǎn)、穩(wěn)定的優(yōu)良菌種，這對(duì)未來蛹蟲草栽培的研究及蟲草產(chǎn)業(yè)發(fā)展有著重要意義。

濟(jì)南市農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(201312)。