胡丹丹，楊國良，樓黎明

盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)法建立的膿毒癥大鼠動物模型不同臟器組織超微結(jié)構(gòu)動態(tài)變化觀察

胡丹丹，楊國良，樓黎明

目的觀察盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)法（CLP）建立的膿毒癥大鼠動物模型心、肝、腎不同臟器組織超微結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化。方法雄性SD大鼠32只，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型6h組和模型24 h組，各8只。CLP建立膿毒癥大鼠動物模型，觀察各組大鼠心肌酶譜、肝腎功能的變化，同時通過透射電鏡觀察各組大鼠心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞及腎小球超微結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果CLP術(shù)后6 h，模型組大鼠心肌細(xì)胞線粒體腫脹，部分肌纖維稀疏；肝細(xì)胞溶解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，線粒體腫脹；腎小球結(jié)構(gòu)未見明顯改變。至術(shù)后24 h，大部分心肌細(xì)胞出現(xiàn)自溶，偶見心肌細(xì)胞呈核固縮、核碎裂等壞死改變；肝細(xì)胞線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)廣泛的空泡變性，細(xì)胞器模糊結(jié)構(gòu)不清；腎小球基底膜部分增厚，部分足突細(xì)胞融合消失，腎小球塌陷等。結(jié)論膿毒癥大鼠早期就存在心、肝等多臟器損傷，腎損傷出現(xiàn)較晚。

盲腸結(jié)扎穿孔；膿毒癥；多臟器損傷

[Modern PracticalMedicine,2016,28(10):1271-1273]

膿毒癥具有發(fā)生率高、病死率高及治療費(fèi)用高等特點(diǎn)，可導(dǎo)致多器官功能受損，包括急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）、急性腎功能衰竭（ARF）、急性心力衰竭（AHF）、急性肝損傷、凝血功能紊亂、骨髓功能抑制、腦損傷以及酸堿平衡紊亂等，進(jìn)而出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征（MODS）。膿毒癥與其并發(fā)癥是重癥監(jiān)護(hù)室患者首要的死因，占10%～50%[1-2]。本文以盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）法制備膿毒癥大鼠動物模型，通過動態(tài)觀察大鼠心、肝、腎等重要臟器超微結(jié)構(gòu)的變化，以期探討膿毒癥臟器損傷的時間。報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物雄性SD大鼠32只，清潔級，體質(zhì)量（200±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供和飼養(yǎng)，許可證號：SYXK（浙）2013-0184。大鼠造模前在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，術(shù)前24h禁食禁水。

1.2 主要儀器及試劑低溫離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge 5804，德國）；Vortex-Genie 2旋渦混合器（SI美國）；AY220精密天平（SHIMADZU日本島津）；自動生化分析儀。2%戊巴比妥鈉（上海西塘生物科技有限公司），PBS原液。

1.3 方法

1.3.1 膿毒癥模型的制備采用CLP法建立膿毒癥大鼠動物模型[3]，100g/L水合氯醛按300mg/kg腹腔注射麻醉后固定，沿腹中線作2.0 cm切口，打開腹腔后小心分離盲腸，避免碰觸腸系膜血管，在盲腸根部結(jié)扎，在與腸系膜相對的盲端腸壁漿膜面用9號針頭穿刺2次，輕擠出少量內(nèi)容物，還納盲腸于腹腔，關(guān)閉腹腔，逐層縫合，術(shù)后即刻予以皮下注射0.9%

氯化鈉注射液10m l/kg補(bǔ)充手術(shù)過程中丟失的體液。

1.3.2 分組及給藥將32只雄性SD大鼠分為正常組、假手術(shù)組、模型6h組和模型24h組，各8只。模型6 h組與模型24 h組行CLP術(shù)；假手術(shù)組麻醉后開腹翻動腸道，關(guān)腹；正常組與其余各組同步飼養(yǎng)。模型6 h組于CLP術(shù)后6 h麻醉，腹主動脈采血處死，其余各組于CLP術(shù)后24h麻醉，腹主動脈采血處死。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 生化指標(biāo)檢測各組術(shù)后檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、肌酸激酶（CK）及肌酸激酶同工酶（CK-MB），送檢浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，使用自動生化分析儀測定。

1.4.2 心、肝、腎臟器組織透射電鏡樣品制備及觀察迅速切取1mm3大小的心肌、左腎腎門及肝左葉組織塊，保持低溫環(huán)境下2.5%戊二醛固定液固定2h以上，0.1M磷酸緩沖液充分洗滌；1%鋨酸后固定1.5 h，磷酸緩沖液清洗0.5 h；梯度酒精脫水；浸透；包埋。制作好包埋塊后，用超薄切片制刀機(jī)分割玻璃條，制成玻璃刀，并用橡皮膏制作水槽。然后在超薄切片機(jī)上進(jìn)行超薄切片。首先1m半薄切片，天青藍(lán)染色，在光鏡下觀察定位，超薄切片，厚度80 nm，撈取切片在事先已做好支持膜的銅網(wǎng)上。超薄切片制作好后，檸檬酸鉛染色液染色12min，蒸餾水清洗三次后，自然晾干，透射電子顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用F或q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)變化比較各組生化指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（≥5.69，均＜0.05），術(shù)后模型6 h及模型24 h ALT、AST、Cr、BUN、CK及CK-MB與假手術(shù)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（≥3.48，均＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠生化指標(biāo)動態(tài)變化比較

2.2 各組不同臟器超微結(jié)構(gòu)動態(tài)變化心肌超微結(jié)構(gòu)：正常組及假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)肌絲、肌節(jié)結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，線粒體排列整齊，肌原纖維結(jié)構(gòu)正常。CLP術(shù)后6 h，心肌細(xì)胞線粒體腫脹，部分肌纖維稀疏。CLP術(shù)后24h，心肌細(xì)胞線粒體腫脹加重，部分空泡變性，大部分心肌細(xì)胞出現(xiàn)自溶，偶見心肌細(xì)胞呈核固縮、核碎裂、胞漿崩解等壞死改變。見封二彩圖3。

肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)：正常組及假手術(shù)組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞漿中有豐富的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體嵴正常而清晰，細(xì)胞核清晰可見。CLP術(shù)后6 h，肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，線粒體腫脹，偶見肝細(xì)胞溶解。CLP術(shù)后24h，肝細(xì)胞胞漿出現(xiàn)部分溶解，線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)廣泛的空泡變性，細(xì)胞器模糊結(jié)構(gòu)不清，部分肝細(xì)胞可見核染色質(zhì)固縮。見封二彩圖4。

腎小球超微結(jié)構(gòu)：正常組及假手術(shù)組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常，基底膜完整，上皮細(xì)胞足突清晰，近曲小管和遠(yuǎn)曲小管結(jié)構(gòu)均正常，細(xì)胞連接清楚，絨毛存在，細(xì)胞器完整。CLP術(shù)后6h，超微結(jié)構(gòu)未見明顯改變，偶見部分足突細(xì)胞變平。CLP術(shù)后24h，腎小球基底膜部分增厚，部分足突細(xì)胞融合消失；腎小球塌陷。見封二彩圖5。

3 討論

膿毒癥動物模型復(fù)制方法可分為細(xì)菌或內(nèi)毒素攻擊模型和局部感染模型兩大類。內(nèi)毒素攻擊模型可控性比較強(qiáng)，動物的反應(yīng)性相對來說比較一致，但費(fèi)用高。CLP模型屬局部感染造模方法，其原理是模擬人類闌尾炎或憩室炎穿孔的病例造成混合性細(xì)菌感染，壞死組織可成為炎癥反應(yīng)來源，CLP模型在距離原發(fā)打擊一定時間后，各器官的生化指標(biāo)均出現(xiàn)不同程度的異常改變，并伴有全身血流動力學(xué)改變和凝血系統(tǒng)功能異常，而細(xì)胞因子水平升高相對平緩，持續(xù)時間長[4]。這些特點(diǎn)與臨床患者實(shí)際情況相近，在局部感染模型上進(jìn)行的抗炎藥物試驗(yàn)取得的結(jié)果也與臨床相似。因此是目前公認(rèn)的臨床相關(guān)性較強(qiáng)的膿毒癥動物模型。

眾所周知，膿毒癥可導(dǎo)致多器官損傷。膿毒癥合并心肌損傷是ICU非心源性死亡的主要原因，也是膿毒癥的常見并發(fā)癥。有數(shù)據(jù)表明，膿毒癥患者40%～50%可發(fā)生心肌抑制[5]，7%可發(fā)生心力衰竭[6]，其機(jī)制可能與炎癥因子對心肌的損傷[7]，心肌細(xì)胞鈣離子超載[8]，氧自由基損傷[9]，能量代謝障礙[10]等相關(guān)。腎臟血流量非常豐富，也是膿毒癥病程中受研究者重視的重要器官之一。膿毒癥、重度膿毒癥以及膿毒癥休克患者并伴發(fā)急性腎損傷(AKI)的概率逐漸增加，依次約為19%、23%和51%，若進(jìn)展為急性腎功能衰竭(ARF)，病死率可高達(dá)70%左右[11-12]，倘若能早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)，就能顯著降低膿毒癥患者的病死率[13]。肝臟不僅是膿毒癥中最易受損的器官之一，還對膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展有舉足輕重的作用，其結(jié)構(gòu)、功能和代謝的變化影響著膿毒癥病情的發(fā)展。急性肝損傷可發(fā)生在膿毒癥的任何階段。早期肝功能障礙是膿毒癥死亡的一項(xiàng)獨(dú)立而實(shí)際的預(yù)警因素，超過傳統(tǒng)的循環(huán)、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等死亡預(yù)警因素[14]。其發(fā)生機(jī)制與肝微循環(huán)與肝血流改變導(dǎo)致肝細(xì)胞缺血缺氧，肝細(xì)胞的能量代謝障礙，內(nèi)毒素直接對庫普弗細(xì)胞的損傷作用等相關(guān)[15]。而對于心、肝、腎等臟器損傷在膿毒癥病程中出現(xiàn)的時間點(diǎn)鮮有報道。

本實(shí)驗(yàn)中生化指標(biāo)檢測提示：CLP術(shù)后6h，CKMB、CK、ALT、AST、BUN均出現(xiàn)不同程度的升高，與假手術(shù)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。至CLP術(shù)后24h，各項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），提示CLP大鼠早期即存在心肌損傷及肝功能損害，腎功能損傷不明顯，后期則多臟器功能受累。超微結(jié)構(gòu)顯示表明，膿毒癥大鼠早期即存在心、肝等多臟器功能損傷，腎損傷出現(xiàn)較晚，隨著時間的延長，心、肝、腎等多臟器損傷，故膿毒癥治療的早期就應(yīng)兼顧臟器功能的保護(hù)。

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Dynamicalchangesofultrastructuralorgans in septic ratmodelestablished by cecal ligation and perforation

HUDandan,YANGGuoliang,LOU Liming.(The Third A ffiliated Hospitalof Zhejiang TraditionalChineseMedicalUniversity,Hangzhou 310005,Zhejiang,China)

Objective To obersvedynamicalchangesofultrastructureofmajororgansin septic ratmodelestablished by cecal ligation and perforation(CLP),including heart,liverand kidney.Methods Thirty-twomale SD ratswere random ly divided into fourgroups:normalgroup,sham-operated group,6-hourmodelgroup and 24-hourmodelgroup.Therewereeightratsineachgroup.Thechangesofmyocardialenzymes,liverand kidney functionwereobserved. The ultrastructural changes ofmyocardial cells,hepatocytes and glomeruliwere observed by transm ission electron microscope.Results Six hoursafterCLP,them itochondriawereswollen and somemuscle fibersweresparse in the modelgroup;atthesame time,the livercelldissolved,them itochondrion of livercellgotswelling,and theendoplasmic reticulum of liver celldecreased;but theglomerularstructure did notchangeobviously.Twenty-fourhoursafter CLP,mostof the cardiomyocytes showed autolysis,and occasionally necrotic changessuch asnuclear pyknosisand nuclear fragmentationwereobserved.Thevacuolardegeneration ofmitochondriaand endoplasmic reticulumin liver cellsand theunclearstructureoforganelleswereunclear.Thebasilarmembraneof renalglomerulus partly gotthick, and footprocesscell fused and disappeared.Conclusions Rats with sepsishad earlymultipleorgan injury,including heartand liver,while kidneywasdamaged later.

Cecal ligation and perforation；Sepsis；Multiple organ injury

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.10.004

R574.61；R632.5

A

1671-0800(2016)10-1271-03

2016-03-14

（本文編輯：鐘美春）

浙江省自然科學(xué)基金（LY12H15004，LQ12H27006）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃（2012ZB069）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院重點(diǎn)項(xiàng)目（ZS10ZA04）

310005杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院（胡丹丹、樓黎明）；浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（楊國良）

樓黎明，Email：llm2348@163.com