薛海波，馬麗麗，林賢凡，吳金明

羊棲菜多糖抗肝纖維化的作用機制的實驗研究

薛海波，馬麗麗，林賢凡，吳金明

目的探究羊棲菜多糖抗肝纖維化的作用機制。方法建立CCl4誘導(dǎo)的SD大鼠肝纖維化模型，觀察血清學(xué)指標(biāo)，大鼠肝臟病理的變化以及對ColⅠ、轉(zhuǎn)化生長因子-（TGF-1）、轉(zhuǎn)錄激活因子（Smad）3、Smad4及Smad7等表達情況的影響。結(jié)果羊棲菜多糖組大鼠血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性均低于模型對照組（均P＜0.05），谷胱甘肽過氧化物酶活性及肝組織中超氧化物歧化酶的含量均高于模型對照組（均P＜0.05），肝組織中羥脯氨酸及丙二醛的含量均低于模型對照組（均P＜0.05），ColⅠ、TGF-1、Smad4、Smad3 mRNA和蛋白的表達均低于模型對照組（均P＜0.05），Smad7 mRNA和蛋白的表達均高于模型對照組（均P＜0.05）；肝星狀細胞TGF-1、Smad3及Smad4mRNA和蛋白的表達均低于正常對照組（均P＜0.05），Smad7mRNA和蛋白的表達均高于正常對照組（均P＜0.05）。結(jié)論羊棲菜多糖能有效改善肝功能，減輕肝組織病理損傷程度，對CCl4所致肝纖維化大鼠具有一定的保護作用，可有效抑制大鼠肝星狀細胞增殖，調(diào)控Smad相關(guān)mRNA及蛋白的表達，減少細胞外基質(zhì)的沉積。

羊棲菜多糖；肝纖維化；作用機制；動物模型

肝纖維化就是肝臟疾病一種多發(fā)現(xiàn)象[1]，是大部分肝性疾病的一個主要的中間環(huán)節(jié)。因此，盡早發(fā)現(xiàn)肝纖維化，致力于有效逆轉(zhuǎn)或抑制，可以達到有效預(yù)防和控制疾病的目的[2]。治療肝纖維化的主要藥物：一是利用加速膠原降解的藥物；二是通過抑制一些膠原合成和分泌的藥物，如秋水仙堿和干擾素。前者研究才剛剛起步，遠不能應(yīng)用于臨床；而后者毒副作用較大，難以推廣使用[3]。近來發(fā)現(xiàn)羊棲菜多糖的主要成分巖藻聚糖硫酸酯在醫(yī)學(xué)方面具有獨特的功效，如多種抗性，降血脂血糖，并且對免疫功能也有一定的影響，而且羊棲菜中羊棲菜多糖含量高[4]，易于提取，毒副作用小。本文探究羊棲菜多糖抗肝纖維化的作用機制，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料成年健康SD大鼠80只，體質(zhì)量310～350 g，購買于國家嚙齒類實驗動物種子中心，SPF級，許可證號：SCXK（京）2009-0017。隨機分成正常對照組和模型組。正常對照組大鼠以0.9%氯化鈉注射液代替。模型組大鼠60只采用50%CCl4花生油溶液灌胃造模，連續(xù)8周，從第9周開始，分成模型對照組、秋水仙素組和羊棲菜多糖組，各20只。模型對照組給予等量的0.9%氯化鈉注射液，秋水仙素組給予秋水仙堿0.2mg，羊棲菜多糖組給予羊棲菜多糖80 mg，以每天1次灌胃，連續(xù)4周。

1.2 觀察指標(biāo)末次給藥24 h后處死大鼠，釆集大鼠血清和肝組織。檢測血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力，肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）、羥脯氨酸（Hyp）及丙二醛（MDA）的含量。體外培養(yǎng)SD大鼠的肝星狀細胞，噻唑藍（MTT）法檢測羊棲菜多糖對肝星狀細胞的抑制作用。以＞90%存活率濃度的羊棲菜多糖對肝星狀細胞進行干預(yù)，通過測定細胞上清液中乳酸脫氫酶的活性評定的細胞毒性，此外采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)和Weaternbilot法分別檢測轉(zhuǎn)化生長因子-（TGF-1）、轉(zhuǎn)錄激活因子（Smad）3、Smad4、Smad7mRNA及其蛋白的表達。

1.3 統(tǒng)計方法應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差表示，多組比較采用方差分析，多重比較采用SND-t檢驗，兩兩比較采用t檢驗；計數(shù)資料比較采用2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠AST、ALT、GSH-PX、Hyp、SOD及MDA比較4組AST、ALT、GSH-PX、Hyp、SOD及MDA差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。秋水仙素組和羊棲菜多糖組大鼠血清中AST和ALT的活性均低于模型對照組（均P＜0.05）。血清中GSH-PX活性及肝組織中SOD的含量均高于模型對照組（均P＜0.05），肝組織中Hyp及MDA的含量均低于模型對照組（均P＜0.05），見表1。

2.2 4組大鼠ColⅠ、TGF-1、Smad3、Smad4及Smad7mRNA和蛋白表達比較

4組肝組織ColⅠ、TGF-1、Smad3、Smad4及Smad7 mRNA和蛋白的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。秋水仙素組和羊棲菜多糖組肝組織ColⅠ、TGF-1、Smad3及Smad4mRNA和蛋白的表達均低于模型對照組（均P＜0.05），Smad7mRNA和蛋白的表達均高于模型對照組（均P＜0.05）。見表2～3。

2.3 3組肝星狀細胞TGF-1、Smad3、Smad4及Smad7mRNA和蛋白表達的影響秋水仙素組和羊棲菜多糖組肝星狀細胞TGF-1、Smad3及Smad4mRNA和蛋白的表達均低于正常對照組（均P＜0.05），Smad7mRNA和蛋白的表達均高于正常對照組（均＜0.05）。見表4～5。

表1 4組大鼠血清AST、ALT、GSH-PX、Hyp、SOD及MDA比較

表2 4組大鼠肝組織ColⅠ、TGF-1、Smad3、Smad4及Smad7mRNA表達比較

表3 4組大鼠肝組織TGF-1、Smad3、Smad4及Smad7蛋白表達比較

表4 3組肝星狀細胞TGF-1、Smad3、Smad4及Smad7mRNA表達的影響

表5 3組肝星狀細胞TGF-1、Smad3、Smad4及Smad7蛋白表達的影響

3 討論

肝纖維化是一個病理生理過程，是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生。任何肝臟損傷在肝臟修復(fù)愈合的過程中都有肝纖維化的過程，如果損傷因素長期不能去除，纖維化長期持續(xù)就會發(fā)展成肝硬化。因此它不是一個獨立的疾病，對于其治療應(yīng)當(dāng)重視對各種原發(fā)病的防治，積極預(yù)防和治療，減少致病因素[5]。目前臨床上主要通過針對肝纖維化原發(fā)病和針對肝纖維化本身兩種治療方式。

羊棲菜多糖是經(jīng)馬尾藻科馬尾藻屬植物羊棲菜精制提取而成的一種羊棲菜提取物，一般有20%、40%和60%3種成分。張杰等[6]發(fā)現(xiàn)，羊棲菜多糖可通過上調(diào)糖尿病大鼠胰島細胞中Glut-2mRNA表達，從而改善大鼠胰島素抵抗、降低血糖。Kim等[7]發(fā)現(xiàn)，羊棲菜多糖可有效的抑制模型大鼠血中膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇的增長，升高高密度脂蛋白膽固醇的含量。張雪琴[8]等發(fā)現(xiàn)，羊棲菜多糖可有效的抑制HSC-T6增殖并能誘導(dǎo)其凋亡、減少MDA分泌及Ⅰ型膠原的表達，進而增加SOD的分泌，從而達到抗纖維化的的效果。

本文顯示，羊棲菜多糖能有效改善肝功能，減輕肝組織病理損傷程度，對CCl4所致肝纖維化大鼠具有一定的保護作用，其機制可能與其抗自由基，抑制脂質(zhì)過氧化有關(guān)；羊棲菜多糖可有效抑制大鼠肝星狀細胞增殖[9]，調(diào)控Smad相關(guān)mRNA及蛋白的表達，減少細胞外基質(zhì)的沉積，推測這是其抗肝纖維化的作用機制之一[10]。

綜上所述，羊棲菜多糖能有效改善肝功能，減輕肝組織病理損傷程度，對CCl4所致肝纖維化大鼠具有一定的保護作用，可有效抑制大鼠肝星狀細胞增殖，調(diào)控Smad相關(guān)mRNA及蛋白的表達，減少細胞外基質(zhì)的沉積。

[1]ShokouhiS,RakhshanM,Gachkar L,etal. Accuracyofbiochemicalmarkersandplatelet countfordiagnosisof liver fibrosisstaging in patientswith liver fibrosis,loghmanhakim& taleghanihospitals,tehran,iran(2000-2004) [J].HepatitisMonthly,2007,7(4):190-197.

[2]嚴全能,陳均忠,陳曉文,等.羊棲菜多糖的分離純化及其對小鼠免疫功能的影響[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2008,24(12):2046-2048.

[3]姬云濤,王娟,張會,等.羊棲菜多糖抑脂沉積及其機制研究[J].中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志,2015,24(1):40-42.

[4]蔣定文,沈先榮,賈福星,等.羊棲菜多糖的提取及純化[J].食品科學(xué),2007,28(12):136-138.

[5]薛風(fēng)照,張慧,章建程,等.羊棲菜多糖及其絡(luò)合物調(diào)節(jié)血脂功能的研究[J].海軍醫(yī)學(xué)雜志,2008,29(1):1-2.

[6]張杰,楊旭東,楊驕霞,等.羊棲菜多糖對糖尿病大鼠胰島細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-2表達的影響[J].中國食物與營養(yǎng),2014, 20(9):76-78.

[7]Kim JW,Kwon YR,Youn KS,etal.Qualitycharacteristicsandantioxidantpropertiesinspray driedand freeze-dried powderpreparedwithpowderedseaweedextracts[J].Korean JournalofFood Science&Technology,2012,44(6):125-130.

[8]張雪琴,吳金明,黃智銘,等.羊棲菜多糖對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細胞增殖活化、氧化損傷及凋亡的影響[J].世界華人消化雜志,2012,20(15):1333-1337.

[9]曹高忠,楚生輝,劉敏,等.羊棲菜多糖提取物急性毒性實驗[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2009,28(12): 1549-1550.

[10]張榮信,楊文明,謝道俊,等.中藥抗肝纖維化藥理基礎(chǔ)研究[J].中醫(yī)藥臨床雜志,2014, 12(2):111-114.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.10.029

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A

1671-0800(2016)10-1317-03

2016-05-22

（本文編輯：孫海兒）

325000浙江省溫州，溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院

薛海波，Email:76899751@ qq.com