王 闖 石建芹 劉繼微 齊潔敏

(承德醫(yī)學(xué)院生理教研室，河北 承德 067000)

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E-選擇素蛋白及mRNA在胃腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

王 闖 石建芹 劉繼微 齊潔敏

(承德醫(yī)學(xué)院生理教研室，河北 承德 067000)

目的 檢測(cè)胃腺癌組織中E-選擇素蛋白及mRNA的表達(dá)及其臨床意義。方法 應(yīng)用免疫組化法、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)90例胃腺癌組織及50例正常胃黏膜組織中E-選擇素蛋白及mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 胃腺癌組織 E-選擇素蛋白及mRNA表達(dá)均高于正常胃黏膜組織(P<0.05)。E-選擇素蛋白及mRNA在胃腺癌組織中的表達(dá)均與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、TNM分期相關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別無(wú)關(guān)(P>0.05)。結(jié)論 E-選擇素與胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，將為評(píng)估胃腺癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移潛能和預(yù)后提供理論依據(jù)。

胃腺癌；E-選擇素

胃腺癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移是宿主細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間相互作用多步驟、多因素的復(fù)雜過(guò)程,該過(guò)程包括癌細(xì)胞間以及癌細(xì)胞和基底膜、細(xì)胞外基質(zhì)之間黏附力的改變，基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，癌細(xì)胞的遷移及癌組織中血管的形成〔1〕。所以作為細(xì)胞黏附分子的E-選擇素在胃腺癌發(fā)生、發(fā)展中有非常重要的作用。E-選擇素在胃腺癌中的表達(dá)及生物學(xué)行為的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用免疫組化(SP法)、RT-PCR技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)E-選擇素蛋白及mRNA在胃腺癌組織中的表達(dá)情況，探討其在胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年11月至2014年5月手術(shù)切除并經(jīng)病理專家確診為胃腺癌患者90例，男56例，女34例；高分化、中分化52例，低分化、未分化38例；平均年齡(62±8.0)歲；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者61例。距離癌灶>10 cm處癌旁正常胃黏膜組織50例(對(duì)照組)，男30例，女20例，平均年齡(61±7.0)歲，兩組間年齡及性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。全組病例術(shù)前均未行激素治療及放化療。

1.2 試劑與方法 免疫組化標(biāo)本經(jīng)中性甲醛液固定后進(jìn)行石蠟包埋，5 μm厚度連續(xù)切片備用；RT-PCR標(biāo)本獲取后立即保存于-80℃的超低溫冰柜內(nèi)。

1.2.1 主要試劑 兔免疫組化試劑盒：北京四正柏生物科技有限公司生產(chǎn)。兔抗E-選擇素多克隆 IgG 抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒和DL1000 DNA Marker均購(gòu)于Takara公司，所有引物序列由上海Invitrogen公司合成。

1.2.2 免疫組化 采用SP法，抗體濃度為1∶100，染色過(guò)程參照免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。陰性對(duì)照：用PBS代替一抗；陽(yáng)性對(duì)照：用已知陽(yáng)性切片組織(試劑公司提供)。E-選擇素陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀，表達(dá)水平采用陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度評(píng)分綜合判定〔2〕。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%；1分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25%；2分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<50%；3分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥50%。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分：陰性，與背景色完全一致；1分：弱陽(yáng)性染色，呈淡黃色，略深于背景色；2分：陽(yáng)性染色，呈中等黃色，明顯深于背景色；3分：強(qiáng)陽(yáng)性染色，呈棕黃色。每張切片總評(píng)分等于陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)+染色強(qiáng)度評(píng)分，總分0～1分為陰性表達(dá)(0)，2～3分為低表達(dá)(+)，4～5分為中強(qiáng)度表達(dá)()，6分以上為高強(qiáng)度表達(dá)()。

1.2.3 RT-PCR 按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)抽提組織總RNA含量，OD260/OD280分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及PCR反應(yīng)體系按照說(shuō)明書(shū)配置，均為20 μl，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA及合成的目的DNA均放在-20℃保存?zhèn)溆?。引物序列：?nèi)參β-actin的上游引物：5'-CCTGTGGCATCCACGAAACT-3'，下游引物：5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'，片段長(zhǎng)度為315 bp；E-選擇素上游引物：5'-CATCATGGAACCGACTGCT-3'，下游引物：5'-ATGGCCACTGCATGACCA-3'，片段長(zhǎng)度為150 bp。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min，最終4℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)采圖，并用Quantity One軟件對(duì)電泳圖進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 E-選擇素在胃腺癌組織、癌旁正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果：圖1可見(jiàn)，瓊脂糖凝膠電泳圖顯示，

M：Marker；1、6：低、未分化組胃腺癌組織；2、5：高、中分化組胃腺癌組織；3、4：癌旁正常胃黏膜組織圖1 胃腺癌組織和癌旁正常胃黏膜組織中E-選擇素mRNA的表達(dá)

在150 bp處、315 bp處有特異性條帶，分別代表E-選擇素、內(nèi)參β-actin，E-選擇素在胃腺癌組和對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量分別為(0.693±0.106)、(0.489±0.024)，二者差異顯著(t=13.148，P< 0.05)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果：E-選擇素蛋白在對(duì)照組中無(wú)表達(dá)。陽(yáng)性產(chǎn)物的表達(dá)主要位定于細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)棕黃色顆粒狀。E-選擇素蛋白在胃腺癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率為70.0%，明顯高于對(duì)照組(χ2=32.202,P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.2 胃腺癌組織E-選擇素蛋白及mRNA的表達(dá)與臨床生物學(xué)行為的關(guān)系 免疫組化檢測(cè)結(jié)果和RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果是一致的，E-選擇素蛋白及mRNA的表達(dá)在胃腺癌組織中的表達(dá)均與年齡、性別無(wú)關(guān)(P>0.05)，均與胃腺癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

圖2 E-選擇素蛋白在不同胃黏膜組織中的表達(dá)(DAB，×200)

組別nE-選擇素蛋白陽(yáng)性甲〔n(%)〕χ2值P值E-選擇素mRNAmRNA表達(dá)量t值P值年齡(歲)<60/≥6029/6119(65.5)/44(72.1)0.409>0.050.663±0.103/0.709±0.1051.713>0.05性別男/女56/3438(67.9)/25(73.5)0.324>0.050.666±0.105/0.711±0.1041.694>0.05分化程度高、中分化/低、未分化52/3829(55.8)/34(89.5)11.877<0.050.602±0.057/0.771±0.02010.923<0.05浸潤(rùn)深度未到漿膜組/達(dá)漿膜組49/4127(55.1)/36(87.8)11.368<0.050.595±0.055/0.768±0.06511.426<0.05轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移組/未轉(zhuǎn)移組61/2936(59.0)/27(93.1)10.875<0.050.617±0.077/0.792±0.01913.423<0.05分期Ⅰ、Ⅱ期/Ⅲ、Ⅳ期47/4326(55.3)/37(86.0)10.096<0.050.613±0.077/0.747±0.0877.845<0.05

3 討 論

選擇素是細(xì)胞黏附分子家族中的成員之一，包括：P-選擇素、L-選擇素和E-選擇素。研究表明，E-選擇素有多種配體：Slex和Slea及相關(guān)的寡聚糖。E-選擇素與其配體結(jié)合后，可能與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)〔3〕。目前已有研究表明E-選擇素在乳腺癌〔4〕、卵巢癌〔5〕、肝癌〔6〕、食管癌〔7〕、結(jié)腸癌〔8〕、膠質(zhì)瘤〔9〕等腫瘤細(xì)胞中都有表達(dá)。仇愛(ài)峰等〔4〕用免疫組化方法檢測(cè)到：乳腺癌組織中E-選擇素表達(dá)顯著高于癌旁組織中的表達(dá)(P<0.01)；乳腺癌組織中 E-選擇素的表達(dá)與腫瘤分期、腫瘤分化程度、腫瘤直徑等明顯相關(guān)，E-選擇素介導(dǎo)了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。史梅英等〔5〕用免疫組化方法檢測(cè)：卵巢癌組織中 E-選擇素表達(dá)陽(yáng)性率高于正常上皮(P<0.01),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中E-選擇素表達(dá)的陽(yáng)性率高于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移癌組織。張寶華等〔6〕用流式細(xì)胞儀及免疫組化檢測(cè)證實(shí)E-選擇素與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)從蛋白水平和基因水平上對(duì)正常胃黏膜組織及胃腺癌組織中E-選擇素蛋白和mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行直觀的檢測(cè)，更好地闡述E-選擇素的表達(dá)情況與臨床生物學(xué)行為(年齡、性別、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期)的關(guān)系，所以技術(shù)方面分別選用免疫組織化學(xué)方法與RT-PCR技術(shù)，數(shù)據(jù)分析顯示兩種檢測(cè)所得結(jié)論一致，從而更準(zhǔn)確地證實(shí)了E-選擇素在胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展中尤其是浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中的重要作用。綜上所述，E-選擇素在胃腺癌中的過(guò)表達(dá)促進(jìn)其發(fā)生、發(fā)展，尤其是從胃腺癌生物學(xué)行為關(guān)系表明，E-選擇素也與胃腺癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但其具體的機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

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〔2015-04-04修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

齊潔敏(1966-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事生殖系統(tǒng)腫瘤研究。

王 闖(1986-)，女，助教，碩士，主要從事于生殖系統(tǒng)腫瘤研究。

R735.2

A

1005-9202(2016)20-5049-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.051