王述菊 馬 駿 孫國杰 沈 峰 李 熙 萬博鵬

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065)

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艾灸對阿爾茨海默病模型大鼠海馬形態(tài)學(xué)的影響

王述菊 馬 駿 孫國杰 沈 峰 李 熙 萬博鵬

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065)

目的 探討艾灸治療對阿爾茨海默(AD)模型大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)的影響。方法 健康雄性15個(gè)月齡SD大鼠40只，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、艾灸組，每組10只。采用雙側(cè)海馬一次性注射聚集態(tài)β淀粉樣蛋白(Aβ)25～35制備AD大鼠模型，造模完成后第 2天開始進(jìn)行艾灸治療，在大鼠“腎俞”、“足三里”、“百會”上方2～3 cm處溫和灸。每日治療1次，每穴艾灸5 min，6 d為1療程，休息1 d后繼續(xù)下1個(gè)療程，共治療3個(gè)療程。HE 染色及透射電鏡觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 HE 染色觀察結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較正常組和假手術(shù)組明顯減少，神經(jīng)細(xì)胞受損缺失，細(xì)胞核固縮。運(yùn)用艾灸治療后，大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞核固縮現(xiàn)象明顯改善，形態(tài)較規(guī)則，排列較整齊。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，Aβ在大鼠腦內(nèi)能引起海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的退行性改變，神經(jīng)元體積縮小，形態(tài)不規(guī)則，線粒體腫脹，基質(zhì)清淡、有空泡，數(shù)目減少，還可見到線粒體嵴呈畸形樣改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，脂褐素沉積增多。運(yùn)用艾灸治療后，大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞水腫明顯減輕，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯改善，線粒體腫脹明顯減輕。結(jié)論 艾灸治療可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)，艾灸對AD模型大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的退行性改變有明顯改善作用。

阿爾茨海默病；Aβ25～35；艾灸；海馬；形態(tài)學(xué)

阿爾茨海默病(AD)臨床上主要表現(xiàn)為記憶能力、判斷能力、學(xué)習(xí)能力、思維能力、認(rèn)知能力以及行動能力、生活自理能力普遍下降，給患者生活質(zhì)量和家庭生活都帶來了困擾。AD 的主要病理特征是神經(jīng)元的選擇性丟失及因超磷酸化Tau蛋白和β淀粉樣蛋白(Aβ)在神經(jīng)元內(nèi)外的異常積聚而分別形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)和老年斑(SP)，Aβ沉積是AD發(fā)病的主要致病因素〔1，2〕。本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)海馬一次性注射聚集態(tài)Aβ25～35制備AD大鼠模型，運(yùn)用艾條溫和灸“腎俞”、“足三里”、“百會”進(jìn)行治療，HE 染色及透射電鏡觀察艾灸治療對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康雄性15個(gè)月齡SD大鼠40只，體重350～450 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供〔合格證:SCXK(鄂)2010-0009〕。先進(jìn)行Y型水迷宮篩選〔3〕，淘汰反應(yīng)過于遲鈍或特別敏感的大鼠，將合格大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、艾灸組，每組10只。

1.2 主要儀器及試劑 ES-2100S電子天平(長沙湘平科技發(fā)展有限公司)，Y型水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所)，DW-5腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司)，臺式牙鉆機(jī)(成都康發(fā)醫(yī)療器械有限公司)，Sartorius分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，5 μl微量進(jìn)樣器(上海安亭微量進(jìn)樣器廠)，TB-718E 型生物組織自動包埋機(jī)(湖北泰維醫(yī)療科技有限公司)，輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(德國Leitz公司)，日產(chǎn) Olympus 光學(xué)顯微鏡，LEICA ULTRACUTUCT超薄切片機(jī)(德國)，F(xiàn)EI Tecnai G212透射電鏡(荷蘭)，Aβ25～35(美國sigma公司)，1%鋨酸、2.5%戊二醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 造模方法 先進(jìn)行Aβ25～35孵育，將Aβ25～35用無菌生理鹽水稀釋成5 μg/μl，密封后放在 37℃培養(yǎng)箱中孵育1 w，老化成具有毒性的聚集狀態(tài)，然后放在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

AD大鼠模型制備采用腦立體定位儀下給予雙側(cè)海馬一次性注射聚集態(tài)Aβ25～35〔4〕。大鼠用10%水合氯醛(40 mg/100 g體重)腹腔注射進(jìn)行麻醉，前后囟保持在同一水平將鼠頭固定在腦立體定位儀上，消毒后剪開頭皮，定位海馬區(qū)〔5，6〕(前囟后3.5 mm，中線旁開2.0 mm，硬腦膜下2.7 mm)，左右兩側(cè)海馬區(qū)定位完成后，用臺式牙鉆機(jī)在此鉆一直徑1 mm的小孔，微量進(jìn)樣器垂直插入，每側(cè)緩慢注射Aβ25～35聚集液1 μl，為了使Aβ25～35聚集液充分浸潤局部組織，注射完畢后留針5 min再緩慢拔針。完成后馬上縫合頭皮，術(shù)后每天肌肉注射青霉素10萬U/只，連續(xù)注射5 d。

1.4 各組處理方法 ①艾灸組：造模完成后第2天開始進(jìn)行艾條溫和灸治療。穴位選取參照華興邦等制定的《大鼠穴位圖譜的研制》〔7〕，采用自制的直徑約8 mm艾條，在大鼠“腎俞”、“足三里”、“百會”穴上方2～3 cm處溫和灸?！澳I俞”位于第2腰椎下兩旁，“足三里”位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處，“百會”位于頂骨正中。“腎俞”、“足三里”穴左右隔日交替使用。每日艾條溫和灸治療1次，每穴艾灸5 min，6 d為1個(gè)療程，休息1 d后繼續(xù)下1個(gè)療程，共治療3個(gè)療程。②模型組：按照前述造模方法制備AD大鼠模型，造模完成后大鼠每日與艾灸組大鼠相同時(shí)間相同方法進(jìn)行抓取、固定，但不進(jìn)行艾條溫和灸治療。③假手術(shù)組：腦立體定位儀下雙側(cè)海馬區(qū)注射等量生理鹽水，其他操作同模型組。④正常組：同步喂養(yǎng)，不做任何處理。

1.5 標(biāo)本采集與檢測

1.5.1 HE 染色觀察 行為學(xué)檢測完成后第 2 天，隨機(jī)在每組取4只大鼠進(jìn)行HE染色觀察。大鼠用10%水合氯醛按照40 mg/100 g體重進(jìn)行腹腔注射麻醉，先用0.9%生理鹽水迅速灌注，再用4%多聚甲醛灌注固定。斷頭快速取腦組織，在視交叉平面前后4 mm處將腦組織冠狀面切開，留取中間部分放置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定過夜。將固定后的腦組織常規(guī)上行脫水、二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋，蠟塊連續(xù)冠狀切片，進(jìn)行 HE 染色。

1.5.2 透射電鏡觀察 行為學(xué)檢測完成后第 2 天，隨機(jī)在每組取4只大鼠用10%水合氯醛按照40 mg/100 g體重進(jìn)行腹腔注射麻醉，先用0.9%生理鹽水快速灌注，再用2.5%戊二醛磷酸緩沖液灌注固定，斷頭快速取腦組織，然后分離出海馬組織。2.5%戊二醛固定，磷酸緩沖液清洗，1%鋨酸后固定，丙酮脫水，環(huán)氧丙烷浸透，環(huán)氧樹脂包埋，聚合后超薄切片機(jī)切片，透射電鏡觀察并攝片記錄。

2 結(jié) 果

正常組和假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完整，排列整齊。模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較正常組和假手術(shù)組明顯減少，神經(jīng)細(xì)胞受損缺失，細(xì)胞核固縮，核仁欠清晰。艾灸組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞核固縮現(xiàn)象明顯改善，形態(tài)較規(guī)則，排列較整齊，見圖1。

透射電鏡觀察結(jié)果顯示：正常組和假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清楚，排列整齊。模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元體積縮小，形態(tài)不規(guī)則，線粒體腫脹，基質(zhì)清淡、有空泡，數(shù)目減少，還可見到線粒體嵴呈畸形樣改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，脂褐素沉積增多。艾灸組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞水腫明顯減輕，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張及線粒體腫脹明顯改善，高爾基體、線粒體、核糖體數(shù)目較模型組明顯增多，見圖2。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)HE 染色觀察圖(HE，×200)

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)透射電鏡觀察圖(標(biāo)尺=0.5 μm)

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AD的病位在腦，其病理性質(zhì)為本虛標(biāo)實(shí)〔8～10〕。本虛主要在于腎精虧虛，髓海不足，腎精虧虛是老年性癡呆的發(fā)病根本，老年性癡呆的發(fā)生與髓海不足有密切關(guān)系，而《素問·逆調(diào)論》中的“腎不生，則髓不能滿”說明了髓海不足的根源在于腎虛不生。其標(biāo)實(shí)在于痰濁、瘀血蒙蔽腦竅，痹阻腦絡(luò)，且與五臟都有著重要關(guān)系。人體臟腑功能失調(diào)，氣血津液運(yùn)行失常，體內(nèi)的痰濁、瘀血日久化為濁毒，濁毒損傷脈絡(luò)可致腦竅失養(yǎng)、神機(jī)不明而發(fā)為癡呆〔11〕。何珊等〔12〕運(yùn)用臟腑辨證中的五臟理論概括AD的中醫(yī)病機(jī)，認(rèn)為腎虛髓減是癡呆發(fā)病的重要因素，肝腎陰虛，脾腎不足，心脾氣血兩虛均可致痰濁、濕氣、瘀血、郁火阻滯腦絡(luò)，閉塞腦竅而發(fā)癡呆，亦可從肺論治，若肺氣宣發(fā)肅降、通調(diào)水道不利，則難免產(chǎn)生痰濁、瘀血而發(fā)病。西醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AD典型的病理改變是Aβ淀粉沉積物和SP的形成以及細(xì)胞內(nèi)NFT和神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目減少、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的炎性改變〔13〕。Aβ的聚集引起了神經(jīng)細(xì)胞的功能紊亂和死亡，最終導(dǎo)致癡呆〔14〕。Aβ纖維沉積的危害，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面〔15〕：①Aβ能夠通過線粒體途徑，導(dǎo)致線粒體內(nèi)過氧化環(huán)境的產(chǎn)生，加重了細(xì)胞器的損傷，從而引起細(xì)胞凋亡；②Aβ可能參與了炎癥反應(yīng)，起到了炎性介質(zhì)的作用，Aβ的累積促成了AD患者病灶處炎性反應(yīng)的強(qiáng)度，同時(shí)激發(fā)NFT的形成。

海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與學(xué)習(xí)和記憶貯存的重要器官，與學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知活動密切相關(guān)〔16，17〕。研究發(fā)現(xiàn)AD 患者的海馬體積出現(xiàn)明顯的萎縮，海馬的體積和徑線長度都相比正常人有所減小〔18〕。實(shí)驗(yàn)研究〔19，20〕將Aβ25～35聚集液一次性注入大鼠雙側(cè)海馬造模后，AD 大鼠出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶功能障礙，證實(shí)了作為學(xué)習(xí)記憶重要結(jié)構(gòu)的海馬組織遭到破壞。針灸因其適應(yīng)證廣泛、操作運(yùn)用簡單、安全無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，引起醫(yī)學(xué)界的高度關(guān)注，針灸在臨床上治療AD療效亦得到充分肯定。艾灸法以其藥物作用和溫?zé)岽碳?，可溫?jīng)通絡(luò)、活血化瘀，軟堅(jiān)散結(jié)、溫腎健脾，益氣補(bǔ)陽、回陽固脫，扶正祛邪，對慢性病及經(jīng)絡(luò)痹阻、陽氣虛寒者尤為適宜。本實(shí)驗(yàn)選用“腎俞”、“足三里”、“百會”艾條溫和灸治療。腎精虧虛為AD發(fā)病之本，腎俞是腎臟精氣輸注于背部的重要腧穴，為腎之背俞穴，艾灸腎俞有調(diào)理臟腑，補(bǔ)益腎精之功。痰濁瘀血痹阻是AD發(fā)病之標(biāo)，而痰濁、瘀血的產(chǎn)生與脾胃運(yùn)化失常有關(guān)。脾胃乃后天之本，氣血生化之源，有腐熟水谷，運(yùn)化水濕之功。足三里是胃腑下合穴，艾灸足三里可健脾和胃，補(bǔ)益氣血，脾胃健運(yùn)則可蠲化痰濁，疏散瘀血。百會位于巔頂，是督脈重要腧穴，而督脈與腦、腎有密切關(guān)系，艾灸百會是近治作用選穴，具有益腎補(bǔ)腦，調(diào)督醒神之功。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明艾灸治療可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)，艾灸對AD模型大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的退行性改變有明顯改善作用。

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〔2015-05-22修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(Q20101803)；武漢市科技局青年科技晨光計(jì)劃項(xiàng)目(201150431126)

馬 駿(1964-)，女，教授，醫(yī)學(xué)博士，主要從事針灸防治腦病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。

王述菊(1977-)，女，副教授，醫(yī)學(xué)博士,主要從事針灸防治腦病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。

R245

A

1005-9202(2016)20-4993-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.022