于 敏 于杜娟

(北華大學附屬醫(yī)院心內科，吉林 吉林 132011)

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氯沙坦逆轉心室重構的作用及機制

于 敏 于杜娟1

(北華大學附屬醫(yī)院心內科，吉林 吉林 132011)

目的 研究氯沙坦對心室重構的逆轉作用及分子信號轉導機制。方法 異丙腎上腺素(Iso)誘導心室重構(VR)模型，觀察氯沙坦對VR影響；通過HE染色、Masson特染、透射電鏡、免疫組織化學染色和Western印跡方法觀察氯沙坦對心肌形態(tài)學和轉化生長因子(TGF)-β1及磷酸化蛋白激酶Cα(p-PKCα)表達的影響。結果 Iso能顯著升高心臟重量(HW)/體重(BW)、VMI、左室舒張末期內徑(LVDd)、左室收縮末期內徑(LVDs)、右室舒張末期左室后壁厚度(LVPWd)、左室收縮末期右室后壁厚度(LVPWs)、心肌纖維直徑(MFD)，氯沙坦通過降低上述各指標對抗Iso誘導的VR；Iso能升高尾動脈血壓，降低心室功能指標射血分數(shù)(EF) 和短軸縮短速率(FS)；氯沙坦能降低尾動脈血壓，提高EF和FS水平，從而減輕VR。結論 Iso通過提高p-PKCα和TGF-β1的表達誘導VR，氯沙坦通過抑制p-PKCα和TGF-β1的表達逆轉VR。

心室重構；氯沙坦；磷酸化蛋白酶C；轉化生長因子-β1

心室重構(VR)的主要病理學改變包括心肌細胞的反應性變化和心肌間質細胞的纖維化兩部分，抑制腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(RAAS)有助于VR的逆轉〔1〕。轉化生長因子(TGF)-β1是細胞生長和分化的調控因子，由心肌細胞在壓力超負荷刺激下所產(chǎn)生并與膜受體結合，激活第二信使如蛋白激酶C(PKC)、絲裂酶原激活的蛋白激酶(MAPK)等促進細胞生長信息的傳遞，誘導RNA和蛋白質合成，從而導致心肌肥厚〔2，3〕。PKC是體內廣泛存在的一大類蘇/絲氨酸激酶家族〔4〕，過度激活的PKC可導致心肌肥厚的發(fā)生〔5〕。

1 材料與方法

1.1 VR模型制備 Wistar大鼠隨機分成對照組，模型組，氯沙坦低、中、高(5.0、10.0和20.0 mg/kg)三個劑量組。參照Rona等〔6〕方法，使用背部皮下注射異丙腎上腺素(Iso)10 d進行造模。各給藥組第二日開始灌胃給藥，連續(xù)14 d，造模和給藥間隔時間4 h以上。對照組背部皮下注射等量生理鹽水，模型組和對照組均用等容積蒸餾水灌胃，末次給藥后禁食24 h，于第15天處死動物。

1.2 多普勒超聲心動圖評價VR大鼠心臟功能 藥物干預14 d后，使用多普勒超聲心動圖對大鼠心臟功能進行評估。形態(tài)學指標包括左室舒張末期內徑(LVDd)及收縮末期內徑(LVDs)，左室舒張末期左室后壁厚度(LVPWd)、左室收縮末期左室后壁厚度(LVPWs)。收縮功能指標包括射血分數(shù)(EF)、短軸縮短率(FS)。

1.3 VR指標檢測 大鼠稱重處死，取出心臟，留取干凈心室，剔除其余組織，電子天平稱取心臟重量(HW)、心室重量(VW)、左室重量(LVW)，心室/體重指數(shù)=心重(mg)/體重(g)。

1.4 心室組織形態(tài)學檢測 取左室近心尖1/2處心肌下部組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，分別行HE染色、Masson膠原纖維特異性染色、醋酸鈾染色。光鏡下觀察心肌組織病理學變化；10×40倍下測量大鼠心肌纖維直徑(MFD)；電鏡下檢測心肌組織超微結構。

1.5 免疫印跡檢測磷酸化PKCα(p-PKCα)蛋白表達 提取心肌組織總蛋白，考馬斯亮藍法進行定量。使用Western印跡方法檢測p-PKCα蛋白表達。

1.6 免疫組織化學染色法檢測左室TGF-β1蛋白表達 給藥結束時于左心室赤道面橫切，甲醛固定，石蠟包埋切片，切片厚度4 μm，Envision法檢測大鼠心臟組織TGF-β1(1∶100)表達。陽性反應呈棕黃色細密顆粒，陰性對照用PBS取代一抗染色為陰性。應用全自動圖像分析儀，在每組隨機選擇4～6個高倍視野自動計數(shù)100個左右的細胞，用Media Cybernetics公司的Image-ProPlus 5.0圖像分析軟件分析各組TGF-β1在心肌組織中表達的平均光密度值。單位面積陽性表達積分光密度=積分光密度/視野面積×100%。TGF-β1陽性反應為黃色至棕黃色顆粒，定位于胞核、近細胞核及細胞質處。

1.7 統(tǒng)計學分析 使用SPSS19.0軟件，組間比較采用t檢驗，采用直線相關分析評估兩組數(shù)據(jù)相關性。

2 結 果

2.1 氯沙坦可減輕Iso誘導大鼠VR病理學改變 對照組心肌肌纖維完整，排列整齊，染色均勻一致(圖1A)；Iso模型組心肌肌纖維斷裂、缺損，排列紊亂，心肌內膜下見大片壞死灶，局限或廣泛呈片狀分布，嚴重者相融合，心室壁全層均被累及，壞死處心肌成纖維細胞增生明顯(圖1B)；氯沙坦干預組心肌肌纖維損傷較Iso模型組明顯減輕，呈片狀(圖1C，1D)或點狀(圖1E)，心肌內膜下多見(圖1F)。

2.2 氯沙坦可減輕Iso誘導大鼠VR膠原纖維增生 模型組心肌壞死灶內纖維增生明顯，膠原纖維明顯增加；氯沙坦治療組膠原纖維受到不同程度抑制。見圖2。

2.3 氯沙坦可減輕Iso誘導大鼠VR超微結構的損傷 電鏡下醋酸鈾染色可見：對照組心肌細胞結構正常，核仁清晰，肌膜及細胞器完整，閏盤、Z線清楚，無膠原纖維增生；模型組心肌細胞結構破壞嚴重，核仁不清楚，肌絲排列紊亂，閏盤及Z線顯示不清，線粒體腫脹，嵴消失、斷裂，內質網(wǎng)腫脹，部分心肌細胞核染色質呈早期凋亡形態(tài)改變，膠原纖維大量增生呈片狀；氯沙坦組較模型組有明顯改善，心肌細胞結構大致正常，閏盤清楚，細胞變性程度較輕，間質略水腫，肌漿網(wǎng)略有擴張，未見明顯壞死，膠原纖維偶見點狀增生，膠原增生明顯受抑，見圖3。

2.4 氯沙坦可減輕Iso誘導的VR大鼠心室增大 與對照組比較，模型組LVDd，LVDs，LVPWd，LVPWs明顯增加(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，氯沙坦各劑量組上述指標不同程度降低(P<0.01)。見表1。

2.5 氯沙坦可改善Iso誘導的VR大鼠心室功能 與對照組比較，模型組MFD及尾動脈壓(CBP)明顯增加，EF和FS明顯下降；氯沙坦三個劑量組均能降低MFD和CBP，提高EF和FS水平(P<0.05，P<0.01)，見表1。

圖1 HE染色檢測氯沙坦對Iso誘導大鼠心肌細胞的影響(×400)

圖2 Masson特殊染色檢測氯沙坦對Iso誘導大鼠心肌細胞的影響

圖3 電子電鏡檢測氯沙坦對Iso誘導大鼠心肌細胞的影響

組別劑量(mg/kg)形態(tài)學指標(d/cm)LVDdLVDsLVPWdLVPWsMFD(μm)CBP(mmHg)收縮功能指標(%)EFFS對照組-0.61±0.050.30±0.020.22±0.020.30±0.0110.7±0.9117±9.853.1±8.351.5±4.8模型組3.00.65±0.061)0.39±0.042)0.28±0.022)0.37±0.042)18.2±1.12)190±12.62)25.3±3.62)35.3±4.72)氯沙坦組5.00.62±0.053)0.36±0.033)0.27±0.023)0.36±0.033)15.6±1.23)160±14.73)32.3±4.73)37.6±3.63)10.00.62±0.033)0.34±0.034)0.25±0.013)0.35±0.023)14.5±1.33)142±12.33)35.6±3.24)40.5±3.93)20.00.61±0.054)0.33±0.024)0.23±0.024)0.31±0.034)12.1±0.84)127±11.54)38.7±3.54)46.7±4.74)

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

2.6 氯沙坦可降低Iso誘導的大鼠HW/BW、LVI 與對照組比較，模型組HW/BW、LVI含量明顯升高(P<0.05或P<0.01)，氯沙坦三個劑量組均能降低HW/BW，LVI水平(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.7 氯沙坦可降低Iso誘導VR中TGF-β1表達 對照組TGF-β1表達量(69.12±19.98)很少；模型組TGF-β1陽性深棕色染色細胞數(shù)明顯增多(166.89±32.65)(P<0.01)，主要分布于胞質中，說明Iso能促進TGF-β1表達；氯沙坦組三個劑量組不同程度地抑制了TGF-β1表達(高、中、低劑量組分別為68.76±23.69、79.90±18.21、101.86±34.38，P<0.05,P<0.01)。見圖4。

2.8 氯沙坦可降低Iso誘導VR中p-PKCα表達 與對照組比較(設為1)，模型組p-PKCα表達(6.73)明顯升高(P<0.001)，氯沙坦高、中、低三個劑量組均能降低VR心肌組織中p-PKCα表達(分別為1.83、2.58、5.07，P<0.05，P<0.01)。見圖5。

表2 氯沙坦對VR大鼠HW/BW、LVI的影響

圖4 氯沙坦對Iso誘導VR 中TGF-β1表達的影響

圖5 Western印跡檢測氯沙坦對Iso誘導VR 中p-PKCα表達的影響

3 討 論

VR是心臟對各種刺激所產(chǎn)生的反應性增生，主要表現(xiàn)為心肌細胞增大和心臟重量增加，左室重構是心血管疾病的獨立危險因素，最終導致心力衰竭甚至猝死。VR包括心肌細胞肥大和心肌間質增殖及心肌細胞外基質(ECM)重建等。心肌纖維化可引起心室重構，包括實質重構和間質重構；前者表現(xiàn)為心肌細胞出現(xiàn)病理性肥大、變性、壞死等改變；后者表現(xiàn)為心肌間質纖維化及ECM膠原網(wǎng)的含量和組成等改變〔7〕。大劑量Iso可引起部分心肌細胞出現(xiàn)變性與壞死、心肌(細胞)肥大、膠原纖維增生等光鏡及電鏡超微結構改變，與缺血性心肌壞死類似〔8〕，可以用于誘導心肌缺血壞死動物模型。氯沙坦各劑量組治療后，其超微結構明顯改善，提示氯沙坦可以逆轉VR引起的心肌超微結構損害，與國內學者的研究結果相似〔9〕。

VR的重要組成部分是心肌間質中基質膠原的增加以及膠原類型、組分和相互連接的改變，為導致心室舒張功能障礙的主要原因〔10〕，HW/BW目前已被用來作為觀察VR的重要指標〔11〕。使用Iso后大鼠心肌出現(xiàn)明顯的間質纖維化。Masson染色顯示應用Iso造模后，心肌間質和血管周圍有大量膠原纖維沉積，證實Iso能造成膠原沉積和心肌肥厚引起VR，氯沙坦能減輕心肌肥厚，抑制心肌間質細胞膠原含量的增加而改善VR，與文獻報道一致〔12〕。

在VR分子機制的研究中，信號轉導途徑已成為近年來關注的焦點和研究熱點，PKC信號轉導通路的激活在心肌肥厚引起的VR中起重要作用〔13〕；PKCα可以介導心肌細胞肥厚，包括蛋白質合成增加、蛋白/DNA比率升高、細胞表面積增大等。TGF-β1是VR發(fā)生中的關鍵因子，通過上調Ⅰ、Ⅲ型膠原合成〔14〕，調節(jié)組織修復〔15〕，調節(jié)ECM蛋白〔16〕并抑制膠原酶的釋放等促進VR生成。本研究發(fā)現(xiàn)，Iso可引起p-PKCα活性升高進而促進TGF-β1的表達，導致心肌肥厚、心肌膠原纖維沉積、ECM增多發(fā)生VR〔17〕；氯沙坦可抑制p-PKCα信號轉導，減少TGF-β1生成，減輕VR。

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〔2016-05-17修回〕

(編輯 郭 菁)

吉林市科委資助課題(201437026)

于杜娟(1980-)，女，主治醫(yī)師，博士，主要從事信號通路的相關研究。

于 敏(1968-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事心肌病的臨床研究。

R542.2

A

1005-9202(2016)20-4982-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.018

1 吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院