張自剛 劉鐵柱 張 寧

(大慶油田總醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 大慶 163001)

?

益母草總生物堿對前列腺增生模型大鼠Bcl-2表達的影響

張自剛 劉鐵柱 張 寧1

(大慶油田總醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 大慶 163001)

目的 探討益母草總生物堿對前列腺增生模型大鼠抑凋亡因子Bcl-2表達的影響及其對良性前列腺增生(BPH)的治療效果。方法 健康SD大鼠65只，雄性，10～12 w，體重250～270 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后開始造模。從中隨機選取55只大鼠，隔日皮下注射丙酸睪丸酮(溶于橄欖油)50 mg/kg連續(xù)4 w，分別為模型組、益母草組及陽性藥組，每組10只，余下大鼠注射10 ml/kg橄欖油，位置及時間間隔同模型大鼠，作為對照組。從造模后1 w開始，益母草組高、中、低劑量組分別按2 ml/100 g灌服益母草總生物堿(100、50、25 mg/kg)；陽性藥組以同體積灌胃癃閉舒膠囊300 mg/kg(溶于10 ml生理鹽水)，模型組和對照組均以等體積的生理鹽水灌胃，均每日1次，每周稱量一次體重，根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量，連續(xù)4 w。結(jié)果 益母草組和陽性藥組均可降低模型大鼠前列腺濕重和前列腺指數(shù)，與模型組相比，差異顯著(P<0.05)。與陽性藥組相比，益母草高、中劑量組下降更顯著(P<0.05)。治療后各治療組Bcl-2表達均減弱，與模型組相比差異顯著(P<0.05)，與陽性藥組相比，益母草高、中劑量組治療后Bcl-2表達減弱更顯著(P<0.05)。益母草高、中劑量組前列腺總體形態(tài)接近對照組，腺體大小基本一致，有少數(shù)增生，極少部分呈乳頭狀突入腔內(nèi)，益母草低劑量組可見腺體增多未明顯改善，向腺腔內(nèi)突出，部分上皮細(xì)胞呈高柱狀，間質(zhì)和血管充血、水腫明顯。陽性藥組光鏡下可見部分腺腔變大，有一部分呈乳頭狀向腔內(nèi)突出，有部分高柱狀上皮。陽性藥組和益母草組大鼠的前列腺上皮皺褶基本消失，腺腔擴張，間質(zhì)有所增厚，其比表面(δ)和比膜面(δm)與模型組相比有明顯差異(P<0.05)，而益母草高、中劑量組與陽性藥組相比也有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論 益母草總生物堿能夠顯著降低前列腺增生模型大鼠Bcl-2表達，對BPH的治療效果明顯，值得推廣。

益母草總生物堿；前列腺增生；Bcl-2

目前，前列腺增生的發(fā)病機制尚不完全清楚，已有的發(fā)病學(xué)說有激素內(nèi)分泌學(xué)說、細(xì)胞凋亡學(xué)說、生長因子學(xué)說等〔1〕。中醫(yī)認(rèn)為前列腺增生的成因是膀胱氣化不利、三焦氣化失司致濕熱瘀血痰濁閉阻膀胱所致〔2〕。益母草是一種常見的中草藥，具有活血化瘀、利水通淋之功?，F(xiàn)代藥理研究表明，益母草具有抑制血小板聚集、抗氧自由基、增強免疫、保鉀利尿等作用〔3〕，提示益母草可能具有治療前列腺增生的功效。高漸聯(lián)〔4〕研究發(fā)現(xiàn)，益母草總生物堿能顯著抑制模型動物前列腺增生，并推測其可能是通過調(diào)解轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1表達水平抑制增生。因此，治療前列腺增生，抑制細(xì)胞增殖是關(guān)鍵。抑凋亡基因Bcl-2是目前僅發(fā)現(xiàn)的與BPH密切相關(guān)的基因，但目前關(guān)于益母草總生物堿治療前列腺增生對Bcl-2表達的影響尚未見報道。因此本試驗通過分析益母草總生物堿對大鼠前列腺細(xì)胞凋亡基因表達的影響，為益母草總生物堿治療前列腺增生提供新證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠65只，雄性，10～12 w，體重250～270 g，北京維通利華實驗動物中心提供。室溫20℃左右，相對濕度40%～60%。環(huán)境光照12 h暗、12 h明。動物自由飲水進食。

1.2 儀器及試劑 丙酸睪丸酮注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司)、益母草總生物堿(含量>80%)、癃閉舒膠囊(石家莊科迪藥業(yè)有限公司)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(北京中杉生物工程公司)、 Bcl-2試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、圖像采集(德國 Lecia 顯微照相系統(tǒng))。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型的建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后開始造模，隨機選取55只大鼠，隔日皮下注射丙酸睪丸酮50 mg/kg(溶于橄欖油，0.1 ml/100 g )，連續(xù)4 w，余下10只大鼠注射10 ml/kg橄欖油，位置及時間間隔與造模大鼠相同。

1.3.2 分組及處理 造模大鼠55只隨機分為模型組、益母草高、中、低劑量組及陽性藥組，每組10只，剩下5只模型大鼠用于模型的驗證。未干預(yù)大鼠作為對照組，從造模后1 w開始，益母草組高、中、低劑量組分別按2 ml/100 g灌服益母草總生物堿(100、50、25 mg/kg)；陽性藥組以相同體積癃閉舒膠囊300 mg/kg(溶于10 ml生理鹽水)灌胃。模型組和對照組均以等體積的生理鹽水灌胃，灌胃均每日1次，每周稱量一次體重，根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量，連續(xù)4 w。

1.4 檢測指標(biāo)及觀察方法

1.4.1 前列腺濕重及前列腺指數(shù) 末次給藥后24 h稱重，脫頸處死大鼠，立即打開腹部，分離前列腺周圍脂肪后摘除前列腺，去除附帶組織，用濾紙吸取表面液體，天平稱量，計算前列腺指數(shù)〔前列腺濕重(mg)/體重(g)×100%〕。

1.4.2 Bcl-2測定 稱重完畢后將前列腺組織于4%多聚甲醛溶液中固定20 h，脫水后石蠟包埋，切片，按照試劑盒說明滴加一抗后磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗標(biāo)本，再滴加二抗。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，光學(xué)樹脂膠封固，醫(yī)學(xué)真彩色計算機圖像全自動分析處理系統(tǒng)觀察并計算陽性細(xì)胞。上皮細(xì)胞層中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，每張切片中隨機選擇10個視野，計算Bcl-2蛋白的平均光密度(MOD)。

1.4.3 前列腺病理學(xué)形態(tài) 將固定后的前列腺組織48 h后常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察其病理學(xué)形態(tài)變化，測定各組大鼠的前列腺比表面(δ)和比膜面(δm)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 模型驗證 造模開始后第29天隨機選取5只大鼠，處死，下腹部切口，找到膀胱，在其后下方找到前列腺，分離周圍脂肪，分離并取出前列腺，固定，石蠟包埋，HE染色，在顯微鏡下觀察，鏡下顯示前列腺腺泡增多，腺腔呈鋸齒擴張明顯并出現(xiàn)乳頭狀增生 (圖1)，證明造模成功。

圖1 大鼠前列腺組織病理圖片

2.2 前列腺濕重及前列腺指數(shù) 與對照組相比，模型組大鼠前列腺濕重和指數(shù)均降低(P<0.05)。與模型組相比，各治療組前列腺濕重及前列腺指數(shù)均明顯下降(P<0.05)；與陽性藥組相比，益母草高、中劑量組前列腺濕重及前列腺指數(shù)下降更顯著(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠前列腺濕重及前列腺指數(shù)±s,n=10)

與對照組相比：1)P<0.05；與模型組相比：2)P<0.05；與陽性藥組相比：3)P<0.05；下表同

2.3 Bcl-2水平變化 與對照組〔(7.74±1.66)%〕相比，模型組大鼠前列腺組織中上皮細(xì)胞層Bcl-2有較強陽性表達〔13.68±3.62)%〕(P<0.05)。與模型組相比，益母草各組和陽性藥組的Bcl-2表達均減弱〔益母草高、中、低劑量組及陽性藥組分別為(8.49±2.59)%、(9.25±1.87)%、(11.93±2.04)%、(10.33±2.70)%,P<0.05〕；與陽性藥組相比，益母草高、中劑量組治療后表達減弱更顯著(P<0.05)。見圖2。

2.4 病理學(xué)改變 對照組光鏡下可見前列腺體大小一致、排列整齊，上皮細(xì)胞呈單層柱狀，表面光滑。模型組可見腺體增多、擴張，向腺腔內(nèi)突出，上皮細(xì)胞呈高柱狀，間質(zhì)和血管充血、水腫。益母草高、中劑量組：前列腺總體形態(tài)接近對照組，腺體大小基本一致，有少數(shù)增生，極少部分呈乳頭狀突入腔內(nèi)；益母草低劑量組可見腺體增多未明顯改善，向腺腔內(nèi)突出，可見部分上皮細(xì)胞呈高柱狀，間質(zhì)和血管充血、水腫明顯。陽性藥組光鏡下可見部分腺腔變大，有一部分呈乳頭狀向腔內(nèi)突出，有部分高柱狀上皮。 見圖3。

圖2 各組大鼠前列腺細(xì)胞Bcl-2免疫組化

圖3 大鼠前列腺組織病理切片

2.5 立體計量學(xué)改變 對照組大鼠的前列腺幾乎沒有皺褶，腺腔正常；模型組大鼠前列腺上皮皺褶明顯增多，腺腔縮小，間質(zhì)變薄。陽性藥組和益母草組前列腺上皮皺褶基本消失，腺腔擴張，間質(zhì)增厚，δ和δm與模型組相比有明顯差異(P<0.05)。益母草中、高劑量組前列腺上皮皺褶基本消失，腺腔擴張，間質(zhì)增厚不明顯，與陽性藥組相比有明顯差異(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠δ和δm比較

3 討 論

細(xì)胞增殖和凋亡的動態(tài)平衡維持了器官細(xì)胞總數(shù)目的恒定。正常前列腺形態(tài)也是細(xì)胞增殖和凋亡的細(xì)胞保持恒定的結(jié)果，是在控制下進行的，在正常組織中，細(xì)胞增殖速率和細(xì)胞死亡速率間存在著平衡，一旦不平衡發(fā)生，則表現(xiàn)為細(xì)胞的增殖增加或細(xì)胞凋亡數(shù)目減少。無論是通過細(xì)胞復(fù)制的增加還是細(xì)胞死亡的減少，都會引起前列腺細(xì)胞的堆積進而反應(yīng)為前列腺的增生〔5〕。Bcl-2基因是目前僅發(fā)現(xiàn)的與BPH密切相關(guān)的基因。以往研究已經(jīng)證實了Bcl-2基因表達可以抑制細(xì)胞的增殖〔6～8〕。本研究首次證明了益母草總生物堿能夠顯著降低Bcl-2表達，因此推測其可能是通過抑制Bcl-2表達促進了前列腺增生細(xì)胞的凋亡，從而達到治療作用。進一步的病理學(xué)檢測和立體計量學(xué)檢測結(jié)果顯示，益母草總生物堿比陽性藥的治療效果更好。

1 Unterbrink A，O′SullivanM，Chen S，etal.TGF beta-1downregulates DMP-1 and DSPP in odontoblasts〔J〕.Connect Tissue Res，2002;43(2-3)：354-8.

2 Gann PH，Klein KG，Chatterton RT，etal.Growth factors in expressed prostatic fluid form men with prostate cancer，BPH，and clinically normal prostates〔J〕.Prostate，1999；40(4)：248-55.

3 Roberts RO，Jacobson DJ,Girman CJ，etal.Insulin-like growth factor i，insulin-like growth factor binding protein 3，and urologic measures of benign prostatic hyperplasia〔J〕.Am J Epidemiol，May 2003；157(7)：784-91.

4 高漸聯(lián).益母草總堿對良性前列腺增生動物模型的作用機理探討〔D〕.鄭州：河南中醫(yī)學(xué)院，2010.

5 王宜梅.益母草的臨床應(yīng)用〔J〕.光明中醫(yī)，2006；21(2)：11.

6 張學(xué)軍，馬騰驤.Bcl-2基因在良性前列腺增生中的作用〔J〕.中華泌尿外科雜志，1997；18(2)：97-9.

7 劉 洋.中醫(yī)藥治療良性前列腺增生機理的研究進展與現(xiàn)狀〔J〕.中國男科學(xué)雜志，2006；20(6)：71-2.

8 洪振豐.良性前列腺增生實驗研究的選擇指標(biāo)〔J〕.中華男科學(xué)雜志，2008；14(9)：771-4.

〔2015-12-30修回〕

(編輯 袁左鳴)

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81372738)

張自剛(1980-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事泌尿系結(jié)石，腫瘤的治療研究。

R69

A

1005-9202(2016)20-4951-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.005

1 北京大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科