胡江平 蔡克瑞 金在順 金花淑 李凱軍

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

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丙戊酸鈉對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)老年斑形成的影響

胡江平 蔡克瑞 金在順 金花淑 李凱軍

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

目的 研究丙戊酸鈉(VPA) 對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)老年斑(SP)形成的影響。方法 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為對照組和VPA治療組，VPA治療后應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)SP的數(shù)量及大小。ELISA測定腦組織β淀粉樣蛋白(Aβ)的含量變化。結(jié)果 VPA治療組小鼠海馬區(qū)域出現(xiàn)的陽性SP數(shù)目與對照組相比分別顯著減少65%，斑塊沉積也分別由0.65%降到0.22%(P<0.01)。ELISA結(jié)果顯示，VPA治療組小鼠腦內(nèi)可溶性Aβ的水平(75 pg/mg)較對照組明顯下降(92 pg/ml，P<0.05)。結(jié)論 VPA可以減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)SP的形成，抑制Aβ的生成。

丙戊酸鈉；阿爾茨海默?。籄PP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠；β淀粉樣蛋白

阿爾茨海默病(AD)的病理特征為細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(Aβ) 沉積形成的老年斑(SP)、細(xì)胞內(nèi)磷酸化tau蛋白聚合形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs) 和選擇性膽堿能神經(jīng)元在學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的腦區(qū)的缺失〔1～3〕。抑制老年斑的形成是治療AD的重要途徑之一。丙戊酸鈉(VPA)是廣泛用于治療癲癇和情感障礙的抗驚厥藥物和情緒穩(wěn)定劑。VPA作為治療雙相情感障礙的主要藥物，能有效控制患者的躁狂和抑郁癥狀，與鋰鹽、卡瑪西平一起作為情緒穩(wěn)定劑。VPA可能的作用機(jī)制主要包括阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡，通過增加神經(jīng)發(fā)生和刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子保護(hù)神經(jīng)元等〔4〕。本文探討VPA對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠AD病理改變的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 APP/PS1 (APPswe/PSEN1dE9) 轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室，通過常規(guī)喂養(yǎng)，繁殖后經(jīng)PCR進(jìn)行基因型鑒定，鑒定后的轉(zhuǎn)基因小鼠用于實(shí)驗(yàn)。小鼠抗Aβ抗體 (Sigma)，小鼠抗GAPDH抗體 (Kangchen)，免疫組織化學(xué)SP試劑盒 (福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，ELISA試劑盒 (Keregen)。紫外分光光度計(jì)，電子天平，水平搖床，Leica石蠟切片機(jī)，Olympus光學(xué)顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及給藥 20周齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為對照組和VPA治療組，每組6只。對照組小鼠腹腔注射生理鹽水，VPA治療組小鼠給予50 mg/kg VPA腹腔注射，1次/d，連續(xù)12 w。

1.2.2 樣本處理 APP/PS1 (APPswe/PSEN1dE9) 轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室，通過常規(guī)喂養(yǎng) (22℃～25℃，50%濕度，12 h光照循環(huán))，繁殖后經(jīng)PCR進(jìn)行基因型鑒定，鑒定后的小鼠用于實(shí)驗(yàn)。將20周齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為對照組和VPA治療組。VPA治療組小鼠腹腔注射VPA (50 mg/kg)，1次/d，對照組小鼠給予等量的生理鹽水。12 w后，小鼠經(jīng)麻醉處死取材，腦組織兩側(cè)半球分開，右側(cè)腦組織于4%多聚甲醛中固定后石蠟包埋，用于免疫組化分析，左側(cè)腦組織-80℃低溫冷凍保存，用于生化檢測、ELISA分析等。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 腦組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，PBS溶液沖洗3次；微波煮沸修復(fù)抗原，自然冷卻后PBS溶液沖洗3次；山羊血清室溫孵育1 h，滴加小鼠抗-Aβ抗體 (1∶5 000)，4℃孵育過夜；PBS溶液沖洗3次后滴加生物素-山羊抗小鼠IgG，室溫孵育2 h，PBS溶液沖洗3次，滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶，室溫孵育1 h；PBS溶液漂洗后DAB顯色，用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，常規(guī)梯度脫水、透明、封片保存。使用Image-Pro Plus軟件測量海馬內(nèi)SP數(shù)量及斑塊沉積，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測Aβ1～40水平 Aβ1～40含量通過ELISA試劑盒測定，操作按照說明書進(jìn)行。腦組織超聲粉碎，離心后取上清液；用標(biāo)本稀釋液稀釋后，每孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品50 μl，加入50 μl生物素標(biāo)記的抗體，震蕩混勻，37℃溫育1 h；去除孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次；每孔加入80 μl的親和鏈霉素-HRP，震蕩混勻，37℃溫育30 min；去除孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次；每孔加入底物A、B各50 μl，震蕩混勻，室溫孵育30 min，37℃孵育10 min，避光；取出酶標(biāo)板，加入50 μl終止液，酶標(biāo)儀450 nm波長測OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Aβ1～40含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 老年SP數(shù)目與斑塊沉積 由于APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的顯著特點(diǎn)是出現(xiàn)明顯的記憶缺失，并且腦內(nèi)SP的數(shù)量隨著年齡的增加而增多，這與AD患者的神經(jīng)病理過程基本一致。本實(shí)驗(yàn)所用的20周齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠處于SP形成早期，給藥12 w后，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察各組小鼠腦內(nèi)SP的數(shù)量及大小，在大腦海馬等部位的陽性SP呈棕黃色(圖1)。VPA治療組小鼠的大腦海馬區(qū)域出現(xiàn)的陽性SP數(shù)目與對照組相比均顯著減少65%，斑塊沉積由0.65%降到0.22%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 腦組織Aβ含量 VPA治療組小鼠腦內(nèi)可溶性Aβ的水平為75 pg/ml，較對照組(92 pg/mg)明顯下降(P<0.05)。

圖1 兩組小鼠腦內(nèi)SP形成(DAB，×200)

3 討 論

目前認(rèn)為多種機(jī)制參與了AD的病理過程，如Aβ毒性、tau蛋白異常修飾等〔5〕。Aβ的產(chǎn)生和代謝不平衡，長期累積會導(dǎo)致Aβ的沉積和SP的形成，引起神經(jīng)元損傷和認(rèn)知功能衰退，在這個(gè)過程中并發(fā)或單獨(dú)發(fā)生NFTs，最終導(dǎo)致神經(jīng)元變性和死亡。Aβ在AD發(fā)病過程中起到了中心和共同通道的作用，所以針對其進(jìn)行治療是防治AD發(fā)生的一個(gè)重要措施。

VPA是廣泛用于治療癲癇和雙向情感障礙的藥物，其安全性和耐受性測試已經(jīng)通過臨床測試〔6〕，但是對常見的退行性疾病的治療還需要進(jìn)一步評估其有效性。VPA可以介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞對Aβ的清除作用，可能是一種潛在的治療AD的藥物。VPA通過增加生長相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)軸突生長，延長細(xì)胞的壽命以及減少腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6產(chǎn)生，抑制核因子(NF)-κB激活，發(fā)揮抗炎作用，對抗炎癥誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷，抑制離子通道、增強(qiáng)γ-氨基丁酸傳遞，調(diào)節(jié)GSK3活性，激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶。VPA減少了小鼠腦內(nèi)SP的形成，抑制了Aβ沉積很可能通過抑制GSK3β進(jìn)而抑制了γ-分泌酶的作用〔7〕。Liao等〔8〕研究表明，人β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1(BACE1)表達(dá)的增加將導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ的異常增多與聚集，對AD的病理過程有顯著影響。因此，抑制BACE1的表達(dá)是降低Aβ的產(chǎn)生及治療AD的一個(gè)有效靶點(diǎn)。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶有突變APP和PS1基因，能夠模擬AD患者腦內(nèi)的一些主要的神經(jīng)病理過程〔9〕，是目前研究AD較好的動物模型。通過對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，VPA對轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ的生成及SP的形成具有抑制作用，與以往的研究結(jié)果一致〔10〕，顯著減少了小鼠腦內(nèi)SP的形成和Aβ的分泌。本研究表明VPA減少Aβ的生成，進(jìn)而抑制SP的形成。

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6 Profenno LA，Jakimovich L，Holt CJ，etal.A randomized，double-blind，placebo-controlled pilot trial of safety and tolerability of two doses of divalproex sodium in outpatients with probable Alzheimer′s disease〔J〕.Curr Alzheimer Res，2005；2(5)：553-8.

7 Smith AM，Gibbons HM，Dragunow M.Valproic acid enhances microglial phagocytosis of amyloid-〔beta〕1-42〔J〕.Neuroscience，2010；169(1)：505-15.

8 Liao W，Jin G，Zhao M，etal.The effect of genistein on the content and activity of α-and β-secretase and protein kinase C in Aβ-injured hippocampal neurons〔J〕.Basic Clin Pharmacol Toxicol,2013;112(3)：182-5.

9 Koivisto H，Grimm MO，Rothhaar TL，etal.Special lipid-based diets alleviate cognitive deficits in the APPswe/PS1dE9 transgenic mouse model of Alzheimer′s disease independent of brain amyloid deposition〔J〕.J Nutr Biochem,2014；25(2)：157-69.

10 Hu JP，Xie JW，Wang CY，etal.Valproate reduces tau phosphorylation via cyclin-dependent kinase 5 and glycogen synthase kinase 3 signaling pathways〔J〕.Brain Res Bull,2011；85(3-4)：194-200.

〔2015-03-04修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

黑龍江省教育廳海外學(xué)人項(xiàng)目(No.1153h16)；黑龍江省教育廳研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目(No.YJSCX2011-298HLJ)

李凱軍(1979-)，男，碩士，講師，主要從事阿爾茨海默病研究。

胡江平(1979-)，女，講師，博士，主要從事阿爾茨海默病研究。

R322.81

A

1005-9202(2016)20-4943-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.002