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        丙戊酸鈉對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)老年斑形成的影響

        2016-11-26 07:29:27胡江平蔡克瑞金在順金花淑李凱軍
        中國老年學(xué)雜志 2016年20期
        關(guān)鍵詞:海馬小鼠

        胡江平 蔡克瑞 金在順 金花淑 李凱軍

        (牡丹江醫(yī)學(xué)院,黑龍江 牡丹江 157011)

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        丙戊酸鈉對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)老年斑形成的影響

        胡江平 蔡克瑞 金在順 金花淑 李凱軍

        (牡丹江醫(yī)學(xué)院,黑龍江 牡丹江 157011)

        目的 研究丙戊酸鈉(VPA) 對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)老年斑(SP)形成的影響。方法 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為對照組和VPA治療組,VPA治療后應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)SP的數(shù)量及大小。ELISA測定腦組織β淀粉樣蛋白(Aβ)的含量變化。結(jié)果 VPA治療組小鼠海馬區(qū)域出現(xiàn)的陽性SP數(shù)目與對照組相比分別顯著減少65%,斑塊沉積也分別由0.65%降到0.22%(P<0.01)。ELISA結(jié)果顯示,VPA治療組小鼠腦內(nèi)可溶性Aβ的水平(75 pg/mg)較對照組明顯下降(92 pg/ml,P<0.05)。結(jié)論 VPA可以減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)SP的形成,抑制Aβ的生成。

        丙戊酸鈉;阿爾茨海默?。籄PP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠;β淀粉樣蛋白

        阿爾茨海默病(AD)的病理特征為細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(Aβ) 沉積形成的老年斑(SP)、細(xì)胞內(nèi)磷酸化tau蛋白聚合形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs) 和選擇性膽堿能神經(jīng)元在學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的腦區(qū)的缺失〔1~3〕。抑制老年斑的形成是治療AD的重要途徑之一。丙戊酸鈉(VPA)是廣泛用于治療癲癇和情感障礙的抗驚厥藥物和情緒穩(wěn)定劑。VPA作為治療雙相情感障礙的主要藥物,能有效控制患者的躁狂和抑郁癥狀,與鋰鹽、卡瑪西平一起作為情緒穩(wěn)定劑。VPA可能的作用機(jī)制主要包括阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡,通過增加神經(jīng)發(fā)生和刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子保護(hù)神經(jīng)元等〔4〕。本文探討VPA對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠AD病理改變的影響及其可能機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 動物、試劑及儀器 APP/PS1 (APPswe/PSEN1dE9) 轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室,通過常規(guī)喂養(yǎng),繁殖后經(jīng)PCR進(jìn)行基因型鑒定,鑒定后的轉(zhuǎn)基因小鼠用于實(shí)驗(yàn)。小鼠抗Aβ抗體 (Sigma),小鼠抗GAPDH抗體 (Kangchen),免疫組織化學(xué)SP試劑盒 (福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司),ELISA試劑盒 (Keregen)。紫外分光光度計(jì),電子天平,水平搖床,Leica石蠟切片機(jī),Olympus光學(xué)顯微鏡。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 分組及給藥 20周齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為對照組和VPA治療組,每組6只。對照組小鼠腹腔注射生理鹽水,VPA治療組小鼠給予50 mg/kg VPA腹腔注射,1次/d,連續(xù)12 w。

        1.2.2 樣本處理 APP/PS1 (APPswe/PSEN1dE9) 轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室,通過常規(guī)喂養(yǎng) (22℃~25℃,50%濕度,12 h光照循環(huán)),繁殖后經(jīng)PCR進(jìn)行基因型鑒定,鑒定后的小鼠用于實(shí)驗(yàn)。將20周齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為對照組和VPA治療組。VPA治療組小鼠腹腔注射VPA (50 mg/kg),1次/d,對照組小鼠給予等量的生理鹽水。12 w后,小鼠經(jīng)麻醉處死取材,腦組織兩側(cè)半球分開,右側(cè)腦組織于4%多聚甲醛中固定后石蠟包埋,用于免疫組化分析,左側(cè)腦組織-80℃低溫冷凍保存,用于生化檢測、ELISA分析等。

        1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 腦組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟,PBS溶液沖洗3次;微波煮沸修復(fù)抗原,自然冷卻后PBS溶液沖洗3次;山羊血清室溫孵育1 h,滴加小鼠抗-Aβ抗體 (1∶5 000),4℃孵育過夜;PBS溶液沖洗3次后滴加生物素-山羊抗小鼠IgG,室溫孵育2 h,PBS溶液沖洗3次,滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶,室溫孵育1 h;PBS溶液漂洗后DAB顯色,用蒸餾水沖洗終止反應(yīng);蘇木素復(fù)染,常規(guī)梯度脫水、透明、封片保存。使用Image-Pro Plus軟件測量海馬內(nèi)SP數(shù)量及斑塊沉積,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

        1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測Aβ1~40水平 Aβ1~40含量通過ELISA試劑盒測定,操作按照說明書進(jìn)行。腦組織超聲粉碎,離心后取上清液;用標(biāo)本稀釋液稀釋后,每孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品50 μl,加入50 μl生物素標(biāo)記的抗體,震蕩混勻,37℃溫育1 h;去除孔內(nèi)液體,用洗滌液洗滌3次;每孔加入80 μl的親和鏈霉素-HRP,震蕩混勻,37℃溫育30 min;去除孔內(nèi)液體,用洗滌液洗滌3次;每孔加入底物A、B各50 μl,震蕩混勻,室溫孵育30 min,37℃孵育10 min,避光;取出酶標(biāo)板,加入50 μl終止液,酶標(biāo)儀450 nm波長測OD值,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Aβ1~40含量。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

        2 結(jié) 果

        2.1 老年SP數(shù)目與斑塊沉積 由于APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的顯著特點(diǎn)是出現(xiàn)明顯的記憶缺失,并且腦內(nèi)SP的數(shù)量隨著年齡的增加而增多,這與AD患者的神經(jīng)病理過程基本一致。本實(shí)驗(yàn)所用的20周齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠處于SP形成早期,給藥12 w后,應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察各組小鼠腦內(nèi)SP的數(shù)量及大小,在大腦海馬等部位的陽性SP呈棕黃色(圖1)。VPA治療組小鼠的大腦海馬區(qū)域出現(xiàn)的陽性SP數(shù)目與對照組相比均顯著減少65%,斑塊沉積由0.65%降到0.22%,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

        2.2 腦組織Aβ含量 VPA治療組小鼠腦內(nèi)可溶性Aβ的水平為75 pg/ml,較對照組(92 pg/mg)明顯下降(P<0.05)。

        圖1 兩組小鼠腦內(nèi)SP形成(DAB,×200)

        3 討 論

        目前認(rèn)為多種機(jī)制參與了AD的病理過程,如Aβ毒性、tau蛋白異常修飾等〔5〕。Aβ的產(chǎn)生和代謝不平衡,長期累積會導(dǎo)致Aβ的沉積和SP的形成,引起神經(jīng)元損傷和認(rèn)知功能衰退,在這個(gè)過程中并發(fā)或單獨(dú)發(fā)生NFTs,最終導(dǎo)致神經(jīng)元變性和死亡。Aβ在AD發(fā)病過程中起到了中心和共同通道的作用,所以針對其進(jìn)行治療是防治AD發(fā)生的一個(gè)重要措施。

        VPA是廣泛用于治療癲癇和雙向情感障礙的藥物,其安全性和耐受性測試已經(jīng)通過臨床測試〔6〕,但是對常見的退行性疾病的治療還需要進(jìn)一步評估其有效性。VPA可以介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞對Aβ的清除作用,可能是一種潛在的治療AD的藥物。VPA通過增加生長相關(guān)蛋白的表達(dá),促進(jìn)軸突生長,延長細(xì)胞的壽命以及減少腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6產(chǎn)生,抑制核因子(NF)-κB激活,發(fā)揮抗炎作用,對抗炎癥誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷,抑制離子通道、增強(qiáng)γ-氨基丁酸傳遞,調(diào)節(jié)GSK3活性,激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶。VPA減少了小鼠腦內(nèi)SP的形成,抑制了Aβ沉積很可能通過抑制GSK3β進(jìn)而抑制了γ-分泌酶的作用〔7〕。Liao等〔8〕研究表明,人β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1(BACE1)表達(dá)的增加將導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ的異常增多與聚集,對AD的病理過程有顯著影響。因此,抑制BACE1的表達(dá)是降低Aβ的產(chǎn)生及治療AD的一個(gè)有效靶點(diǎn)。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶有突變APP和PS1基因,能夠模擬AD患者腦內(nèi)的一些主要的神經(jīng)病理過程〔9〕,是目前研究AD較好的動物模型。通過對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn),VPA對轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ的生成及SP的形成具有抑制作用,與以往的研究結(jié)果一致〔10〕,顯著減少了小鼠腦內(nèi)SP的形成和Aβ的分泌。本研究表明VPA減少Aβ的生成,進(jìn)而抑制SP的形成。

        1 Zhang LH,Wang X,Zheng ZH,etal.Altered expression and distribution of zinc transporters in APP/PS1 transgenic mouse brain〔J〕.Neurobiol Aging,2010;31(1):74-87.

        2 Saido TC.Metabolism of amyloid β peptide and pathogenesis of Alzheimer′s disease〔J〕.Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci,2013;89(7):321-39.

        3 Smith IF,Hitt B,Green KN,etal.Enhanced caffeine-induced Ca2+release in the 3xTg-AD mouse model of Alzheimer′s disease〔J〕.J Neurochem,2005;94(6):1711-8.

        4 Qing H,He G,Ly PT,etal.Valproic acid inhibits A beta production,neuritic plaque formation,and behavioral deficits in Alzheimer′s disease mouse models〔J〕.J Exp Med,2008;205(12):2781-9.

        5 李凱軍,胡江平.雌二醇對岡田酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白磷酸化的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2014;34(2):412-3.

        6 Profenno LA,Jakimovich L,Holt CJ,etal.A randomized,double-blind,placebo-controlled pilot trial of safety and tolerability of two doses of divalproex sodium in outpatients with probable Alzheimer′s disease〔J〕.Curr Alzheimer Res,2005;2(5):553-8.

        7 Smith AM,Gibbons HM,Dragunow M.Valproic acid enhances microglial phagocytosis of amyloid-〔beta〕1-42〔J〕.Neuroscience,2010;169(1):505-15.

        8 Liao W,Jin G,Zhao M,etal.The effect of genistein on the content and activity of α-and β-secretase and protein kinase C in Aβ-injured hippocampal neurons〔J〕.Basic Clin Pharmacol Toxicol,2013;112(3):182-5.

        9 Koivisto H,Grimm MO,Rothhaar TL,etal.Special lipid-based diets alleviate cognitive deficits in the APPswe/PS1dE9 transgenic mouse model of Alzheimer′s disease independent of brain amyloid deposition〔J〕.J Nutr Biochem,2014;25(2):157-69.

        10 Hu JP,Xie JW,Wang CY,etal.Valproate reduces tau phosphorylation via cyclin-dependent kinase 5 and glycogen synthase kinase 3 signaling pathways〔J〕.Brain Res Bull,2011;85(3-4):194-200.

        〔2015-03-04修回〕

        (編輯 苑云杰/曹夢園)

        黑龍江省教育廳海外學(xué)人項(xiàng)目(No.1153h16);黑龍江省教育廳研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目(No.YJSCX2011-298HLJ)

        李凱軍(1979-),男,碩士,講師,主要從事阿爾茨海默病研究。

        胡江平(1979-),女,講師,博士,主要從事阿爾茨海默病研究。

        R322.81

        A

        1005-9202(2016)20-4943-02;

        10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.002

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