宋玉榮，王文艷，衛(wèi) 兵

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定坤丹對多囊卵巢模型大鼠生殖功能的影響

宋玉榮，王文艷，衛(wèi) 兵

目的 研究定坤丹對多囊卵巢綜合征(PCOS)模型大鼠生殖功能的影響。方法 采用丙酸睪酮注射液聯(lián)合絨促性腺素造模法建立PCOS模型，比較給藥前后大鼠卵巢形態(tài)學、性激素水平、卵巢中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及子宮內(nèi)膜同源框基因A10(HOXA10)表達情況。結(jié)果 與模型組大鼠比較，定坤丹組卵巢內(nèi)黃體數(shù)增加，血清促黃體生成素(LH)與雄激素(T)下降，卵泡刺激素(FSH)上升，卵巢VEGF表達下降，子宮HOXA10基因表達上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 定坤丹對PCOS模型大鼠具有促排卵、提高子宮內(nèi)膜容受性作用。其機制可能與調(diào)節(jié)多囊卵巢模型大鼠體內(nèi)性激素水平、減少卵巢中VEGF表達、增加子宮HOXA10表達有關(guān)。

多囊卵巢綜合征；定坤丹；血管內(nèi)皮生長因子；同源框基因A10

多囊卵巢綜合征(polycysticovarysyndrome，PCOS)是婦科常見生殖內(nèi)分泌代謝紊亂的疾病之一。PCOS是一種雄激素過多、伴有慢性無排卵和多囊卵巢形態(tài)等一系列變化的生殖內(nèi)分泌紊亂疾病[1]。目前PCOS病因及發(fā)病機制不明確，發(fā)病機制可能與代謝、胰島素抵抗、免疫反應(yīng)及炎癥、血管生成學說等相關(guān)。臨床常表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)、多毛、痤瘡、不孕等癥狀。治療方式以藥物為主，常用藥物副作用大、復發(fā)率高，因此需尋求副作用小及療效確切的藥物。定坤丹具有滋補氣血、活血化瘀、理氣疏郁的功效。目前定坤丹對治療PCOS尚無文獻報道。該研究以卵巢形態(tài)學、性激素、卵巢血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、子宮內(nèi)膜同源框基因A10(homeoboxgeneA10，HOXA10)為研究指標，研究定坤丹對多囊卵巢模型大鼠的內(nèi)分泌調(diào)控及促排卵、子宮內(nèi)膜容受性方面的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 定坤丹(山西廣譽國藥有限公司)；枸櫞酸氯米芬膠囊(上海衡山藥業(yè)有限公司)；丙酸睪酮注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司)；絨促性腺素(麗珠集團麗珠制藥廠)；卵泡刺激素(folliclestimulatinghormone,FSH)、促黃體生成素(luteinizinghormone,LH)、睪酮(androgen,T)(武漢華美生物有限公司)；HOXA10抗體(美國Abcam公司)；VEGF抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.1.2 動物 21dSPF級雌性SD乳鼠61只，50～60g，由安徽醫(yī)科大學動物實驗中心提供，乳鼠飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學動物實驗室，室內(nèi)溫度25 ℃，顆粒飼料常規(guī)飼養(yǎng)，飲用自來水。

1.2 方法

1.2.1 多囊卵巢大鼠模型建立 根據(jù)Belooseskyetal[2]造模方法建立模型，50只大鼠于23日齡起頸背部皮下注射丙酸睪酮(1.25mg/只，1次/d)及絨促性腺素(1.5IU/只，2次/d)，持續(xù)5周。另外11只為正常組，同期皮下注射食用橄欖油(0.05ml，1次/d)及生理鹽水(0.1ml/只，2次/d)，持續(xù)5 周。期間大鼠每周測體重1次，造模最后10d，大鼠每日行陰道涂片檢查。

1.2.2 模型檢測與納入標準 陰道涂片提示建立模型的50只大鼠中有43只動情周期失去規(guī)律性變化，鏡下見大量持續(xù)角化細胞，正常組11只仍保持規(guī)律的動情周期。從失去動情周期43只大鼠中隨機選取10只處死，處死后取卵巢，顯示卵巢體積增大，表面見囊狀擴張明顯的卵泡，4%甲醛固定12h后行HE染色，鏡下觀察顯示大鼠卵泡膜層增厚，顆粒細胞層數(shù)減少，卵巢間質(zhì)細胞增生明顯，其下有較多早期發(fā)育的小卵泡與閉鎖卵泡，卵泡囊狀擴張明顯，提示模型復制成功。

1.2.3 實驗分組及給藥 結(jié)合陰道涂片及卵巢HE染色確定造模成功，43只大鼠中剩下的33只大鼠隨機分為3組，模型對照組、定坤丹組、克羅米芬組。根據(jù)《實驗動物學》藥物劑量，定坤丹組2.20g/(kg·d)，克羅米芬組5mg/(kg·d)，模型對照組、正常組每只給予等量蒸餾水灌胃，每日1次，共3周，期間正常組1只因灌胃操作不規(guī)范死亡。

1.3 指標檢測與方法 給藥期間每周大鼠測體重1次，比較大鼠用藥前后體重。用藥3周后摘取卵巢及子宮，比較卵巢體重。取腹主動脈血行血清學檢測，HE染色，鏡下觀察卵巢形態(tài)；免疫組化檢測卵巢VEGF及子宮內(nèi)膜HOXA10基因表達。

1.3.1ELISA法檢測大鼠血清中性激素 末次給藥后禁食過夜，次日2%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)腹腔麻醉后打開腹腔取腹主動脈血，血液收集于1.5mlEP管中，靜置2h，分離血清(2 000r/min、15min)，將血清置于-20 ℃冰箱保存。根據(jù)ELISA說明書測T、LH、FSH，用酶標儀測定光密度(opticaldensity,OD)值，繪制標準曲線，通過標準曲線測濃度。

1.3.2HE染色 取卵巢及子宮，卵巢稱重，4%甲醛固定，卵巢固定12h，脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、HE染色、中性塑膠封片，光學顯微鏡觀察卵巢形態(tài)。

1.3.3 免疫組化檢測 卵巢及子宮固定12h，脫水、包埋、切片分別按照山羊超敏二步法及通用型二步法檢測試劑盒操作說明操作。免疫組化二步法測定VEGF在大鼠卵巢組織中的表達及HOXA10在子宮內(nèi)膜組織中的表達，每個樣本隨機選取5個不重疊高倍鏡(40×10)視野進行觀察拍照，采用ImageProplus軟件分析圖像，對所有切片中陽性區(qū)域的單位OD值進行定量分析，測定VEGF及HOXA10的平均OD值，反應(yīng)卵巢組織中VEGF及子宮組織中HOXA10基因表達水平。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠體重比較 4組大鼠體重差異有統(tǒng)計學意義(F=16.46，P<0.01)。模型對照組大鼠較正常組體重增長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。定坤丹組與克羅米芬組大鼠較模型組大鼠體重減輕，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。定坤丹組體重減輕明顯，與克羅米芬組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 4組大鼠卵巢體重比較 4組大鼠卵巢體重差異有統(tǒng)計學意義(F=18.56，P<0.01)。與正常組比較，模型對照組卵巢重量增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型對照組比較，定坤丹組卵巢重量減輕，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，克羅米芬組重量下降，差異無統(tǒng)計學意義。與克羅米芬組比較，定坤丹組卵巢重量減輕，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠體重和卵巢重量比較±s)

與正常組比較：*P<0.05;與模型對照組比較：#P<0.05

2.3 4組大鼠性激素比較 4組大鼠血清LH、FSH、T濃度差異有統(tǒng)計學意義(F=32.47、15.49、7.36，P<0.01)。與正常組比較，模型對照組LH、T升高、FSH下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型對照組比較，定坤丹組LH及T下降、FSH升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；克羅米芬組LH下降、FSH升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，T濃度差異無統(tǒng)計學意義。與克羅米芬組比較，定坤丹組LH、T下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，F(xiàn)SH濃度差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 各組大鼠LH、FSH、T比較

與正常組比較：*P<0.05；與模型對照組比較：#P<0.05

2.4 卵巢鏡下形態(tài)觀察 鏡下觀察：正常組見顆粒細胞多層，見多個黃體；模型對照組見顆粒細胞層數(shù)減少，卵泡囊狀擴張明顯，卵泡膜細胞層及白膜增厚，未見黃體；定坤丹組及克羅米芬組顆粒細胞層數(shù)增多，白膜及卵泡膜細胞層較模型組變薄，黃體數(shù)目增多，見圖1。

2.5 模型對照組卵巢大體形態(tài) 模型對照組大鼠卵巢重量增加，體積增大明顯，部分水腫，卵巢表面見多個透明擴張的卵泡，見圖2。

2.6 免疫組化二步法檢測結(jié)果VEGF表達的陽性信號為淺棕色至深棕色顆粒，卵巢顆粒細胞、卵泡膜細胞及間質(zhì)細胞均有表達。半定量實驗結(jié)果：4組大鼠卵巢組織VEGF表達差異有統(tǒng)計學意義(F=17.54，P<0.05)。與正常組比較，模型對照組VEGF表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型對照組比較，定坤丹組VEGF表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，克羅米芬組VEGF表達差異無統(tǒng)計學意義。與正常組比較，定坤丹組VEGF表達差異無統(tǒng)計學意義，見圖3、表3。

圖1 各組大鼠卵巢形態(tài)學 HE×400

：正常組；B：模型對照組；C：定坤丹組；D：克羅米芬組

圖2 模型對照組大鼠卵巢大體形態(tài)

圖3 各組大鼠卵巢組織中VEGF的表達 免疫組化×400

：正常組；B：模型對照組；C：定坤丹組；D：克羅米芬組

2.7 免疫組化二步法檢測HOXA10基因表達HOXA10基因表達信號為淺棕色至深棕色顆粒，子宮內(nèi)膜腺上皮、腔上皮細胞質(zhì)，間質(zhì)細胞核及細胞質(zhì)均有表達。半定量分析結(jié)果：4組大鼠子宮內(nèi)膜HOXA10基因表達差異有統(tǒng)計學意義(F=11.21，P<0.05)。與正常組比較，模型對照組大鼠子宮HOXA10表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型對照組比較，定坤丹組HOXA10表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，克羅米芬組表達差異無統(tǒng)計學意義。與正常組比較，定坤丹組HOXA10表達差異無統(tǒng)計學意義，見圖4、表3。

圖4 各組大鼠子宮內(nèi)膜HOXA10

：正常組；B：模型對照組；C：定坤丹組；D：克羅米芬組

表3 各組大鼠卵巢VEGF及子宮HOXA10基因平均OD值

與正常組比較：*P<0.05：與模型對照組比較：#P<0.05

3 討論

PCOS是孕齡期婦女月經(jīng)紊亂常見的一種疾病，同時也是不孕癥的主要原因之一，我國孕齡婦女患病率約為5%～10%，占無排卵性不孕癥的75%[3]，目前病因、機制復雜，不明確，臨床表現(xiàn)呈多態(tài)性，治療困難。其發(fā)病機制可能為下丘腦-垂體-卵巢軸失調(diào)、胰島素抵抗、腎上腺功能異常，生長激素、類胰島素樣生長因子及受體、結(jié)合蛋白等分泌失常有關(guān)[4]。研究[5]表明PCOS發(fā)病與血管生成有關(guān)，VEGF被認為可能參與了PCOS的發(fā)病。VEGF是一種多功能的生長因子，可以促進血管內(nèi)皮有絲分裂，促進新生血管形成，增加血管通透性。PCOS患者體內(nèi)VEGF過多導致卵巢內(nèi)膜和間質(zhì)增生及血管增多，卵巢血管生成異常導致不排卵。Abramovichetal[5]發(fā)現(xiàn)下調(diào)VEGF的表達可促進卵泡的排卵和發(fā)育。本次實驗結(jié)果顯示定坤丹降低卵巢中VEGF含量，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。

PCOS患者存在妊娠率低、流產(chǎn)率高，研究[6]顯示主要原因之一是子宮內(nèi)膜容受性低。子宮內(nèi)膜容受性是指母體子宮內(nèi)膜處于一種允許胚泡黏附、穿透并植入的狀態(tài)[7]。PCOS妊娠率低的原之一是胚泡著床障礙，而子宮內(nèi)膜容受性低是阻礙胚泡著床的主要因素之一。HOXA10是目前公認的PCOS子宮內(nèi)膜相關(guān)基因，HOXA10是一種多效性轉(zhuǎn)錄因子，參與胚胎種植的各個環(huán)節(jié)，具有控制胚胎發(fā)育和調(diào)節(jié)細胞分化的作用，如子宮內(nèi)膜的增殖與分化、子宮內(nèi)膜容受性建立、胚胎定位、黏附及胞飲突形成、蛻膜化等，是胚胎著床和成功妊娠所必須的。無排卵患者子宮內(nèi)膜HOXA10表達普遍低于正常者。HOXA10表達受多種因素影響，雌孕激素上調(diào)HOXA10表達,睪酮阻斷HOXA10表達。體外研究[8]表明, 雄激素可直接降低子宮內(nèi)膜HOXA10的表達, 提示降低雄激素可能有助于改善子宮內(nèi)膜的容受性。此次實驗數(shù)據(jù)可以看出，與正常組比較，模型對照組雄激素高、HOXA10基因表達低，差異有統(tǒng)計學意義。定坤丹能顯著降低血清雄激素，提高子宮內(nèi)膜HOXA10表達，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。

目前PCOS主要治療方法是藥物治療，藥物治療目的是調(diào)整月經(jīng)周期及促排卵。促排卵常用的一線藥物克羅米芬，具有高排卵、低懷孕率特點，且20%～25%患者對克羅米芬無反應(yīng)[9]?？肆_米芬干擾體內(nèi)激素分泌，子宮內(nèi)膜容受性低是其低妊娠率原因之一。本次實驗結(jié)果顯示與模型對照組比較，克羅米芬組子宮內(nèi)膜HOXA10表達差異無統(tǒng)計學意義，即無提高子宮內(nèi)膜容受性作用。中醫(yī)認為PCOS基本機制為腎虛血瘀。定坤丹具有調(diào)補肝腎、益氣養(yǎng)血、暖宮功效，主要用于不孕癥及月經(jīng)不調(diào)的治療。與模型對照組比較，定坤丹組大鼠體重及卵巢重量減輕，大鼠卵巢內(nèi)卵泡成熟，黃體數(shù)增加。定坤丹對于多囊卵巢模型大鼠有促排卵作用，其機制可能通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸，降低黃體生成素及雄激素，升高卵泡刺激素，抑制卵巢VEGF表達,抑制卵巢新生血管形成，改善卵巢血流，提高卵泡質(zhì)量，促進卵巢排卵。定坤丹具有提高子宮內(nèi)膜容受性作用，機制可能與改善大鼠體內(nèi)激素分泌、降低雄激素、上調(diào)HOXA10表達有關(guān)。本次實驗為臨床使用定坤丹治療PCOS提供了一定的實驗依據(jù)。

[1]Turner-McGrievyGM,DavidsonCR,WingardEE,etal.Lowglycemicindexveganorlow-calorieweightlossdietsforwomenwithpolycysticovarysyndrome:arandomizedcontrolledfeasibilitystudy[J].NutrRes,2014,34(6):552-8.

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Eeffects of Ding Kundan on the function of polycystic ovary model rats

SongYurong,WanWenyan,WeiBing

(Dept of Gynecology and Obstetrics,The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230601)

Objective To study the influence of Ding Kundan on the reproductive function of polycystic ovary syn-

polycystic ovary syndrome; Ding Kundan; vascular endothelial growth factor ; homeobox gene A10

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.017.html

2016-05-30接收

國家自然科學基金青年科學基金(編號：81100412)；安徽省公益性研究聯(lián)動計劃項目(編號：5101ID04041)

安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，合肥 230601

宋玉榮，女，碩士研究生；

衛(wèi) 兵，男，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail:weibing1965@hotmai.com

R711.51

A

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.017

drome model rats.Methods The PCOS model was established by using testosterone propionate injection combined with humen chorinic gonadotropin to compare rat ovarian morphology, sex hormones levels,the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) in ovary and homeobox gene A10(HOXA10) in uterus before and after drug administration.Results In a comparison to the model group,the number of ovarian corpus luteum of the Ding Kundan group was increased, and the serum luteinizing hormone(LH) and androgens (T) level of the Ding Kundan group declined, but follicle stimulating hormone(FSH) increased,the expression of VEGF in ovary reduced while HOXA10 in uterine rose. On top of that, their differences were statistically significant(P<0.05).Conclusion Ding Kundan has the function of promoting ovulation and can increase the role of endometrial receptivity. The mechanism may relate to the regulation of the serum sex hormones levels, the decrease of VEGF expression in ovary, and the addition of HOXA10 in uterus in PCOS model rats.