李應(yīng)配，羅時(shí)猛，冷銀芝，陸曉桐，張書(shū)雅，蔣建華，朱啟星，沈 彤,

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雙酚A誘導(dǎo)肥胖小鼠中脂肪組織巨噬細(xì)胞聚集

李應(yīng)配1，羅時(shí)猛1，冷銀芝1，陸曉桐2，張書(shū)雅2，蔣建華3，朱啟星4，沈 彤1,4

目的 研究飲水?dāng)z入低劑量雙酚A(BPA)誘導(dǎo)的肥胖小鼠中脂肪組織巨噬細(xì)胞的聚集。方法 將4周齡雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常飲食(ND)組和高脂飲食(HFD)組，每組再分別設(shè)溶劑對(duì)照組、10 nmol/L BPA組、100 nmol/L BPA組和1 000 nmol/L BPA組。小鼠經(jīng)飲水?dāng)z取BPA，20周后稱(chēng)量體重，處死，無(wú)菌取附睪脂肪墊，HE染色觀(guān)察脂肪組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，免疫組化法檢測(cè)脂肪組織IL-6的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)分析脂肪組織血管基質(zhì)成分(SVF)巨噬細(xì)胞比例。結(jié)果 與各自對(duì)照組比較，ND和HFD小鼠BPA暴露組體重和附睪脂肪墊系數(shù)明顯升高(P<0.05)，且隨BPA劑量的增加而上升(P<0.05)；BPA暴露組脂肪組織脂肪細(xì)胞體積和細(xì)胞間隙增大，間隙有炎細(xì)胞浸潤(rùn)；BPA暴露可致脂肪組織炎性因子IL-6表達(dá)上調(diào)和附睪脂肪墊SVF中巨噬細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 低劑量BPA暴露可以誘導(dǎo)小鼠肥胖，而脂肪組織巨噬細(xì)胞的聚集可能與BPA誘導(dǎo)肥胖相關(guān)。

雙酚A；炎癥；脂肪組織巨噬細(xì)胞

雙酚A(bisphenol A，BPA)是制造環(huán)氧樹(shù)脂、聚碳酸酯等的單體，廣泛應(yīng)用于食品包裝材料、飲料容器、生產(chǎn)牙套等塑料工業(yè)，已成為世界上年產(chǎn)量最大的化學(xué)制品之一。研究[1]報(bào)道人體多種生物樣本都可檢測(cè)到BPA，表明人類(lèi)已廣泛暴露于環(huán)境BPA。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群研究[2-5]均表明BPA暴露與超重和肥胖顯著相關(guān)，但是具體機(jī)制尚不清楚。肥胖是一種全身慢性低度炎癥的病理狀態(tài)，在脂肪組織中有大量脂肪組織巨噬細(xì)胞(adipose tissue macrophages，ATM)的浸潤(rùn)，而且不斷聚集、激活，增加脂肪組織中炎癥因子分泌[6]。研究[7-8]顯示，BPA暴露可以下調(diào)巨噬細(xì)胞的活力，從而影響其功能。研究[9]表明BPA可以調(diào)控人類(lèi)脂肪組織巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)，影響炎性應(yīng)答。但BPA誘導(dǎo)肥胖中脂肪組織巨噬細(xì)胞的聚集目前仍未見(jiàn)報(bào)道。該研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究長(zhǎng)期低劑量BPA暴露誘導(dǎo)肥胖小鼠中脂肪組織巨噬細(xì)胞的聚集，為闡明BPA與肥胖間關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 BPA(99.9%分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司)；二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)(美國(guó)Sigma 公司)；BPA用DMSO溶解(DMSO終濃度不超過(guò)1%)；藻紅蛋白(phyocoerythrin, PE)-anti-F4/80抗體(美國(guó)Biolegend公司)；兔來(lái)源多克隆IL-6抗體(稀釋比1 ∶100)(武漢Elabscience生物公司)；通用型生物素(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和處理 SPF級(jí) 4周雄性C57BL/6小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，自由進(jìn)食，溫度維持在約25 ℃，12 h光照和12 h黑暗的晝夜環(huán)境。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常飲食(normal diet，ND，12%脂肪能量)組和高脂飲食(high fat diet，HFD，45%脂肪能量)組，每組分別設(shè)溶劑對(duì)照組、10 nmol/L BPA組、100 nmol/L BPA組和1 000 nmol/L BPA組，每組6只小鼠。小鼠經(jīng)飲水?dāng)z入不同濃度的BPA，每天觀(guān)察小鼠狀態(tài)并記錄飲水量和飼料消耗量，每周稱(chēng)體重1次。為保持飲水中BPA含量，每2 d換水1次。處理20周后稱(chēng)量體重，處死小鼠，無(wú)菌取附睪脂肪墊并稱(chēng)重。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，按照安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物規(guī)范進(jìn)行。

1.3 組織病理學(xué)觀(guān)察附睪脂肪組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn) 取新鮮附睪脂肪組織，用4%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋，制成5 μm切片。脫蠟、HE染色、中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀(guān)察脂肪組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.4 免疫組化法檢測(cè)附睪脂肪組織IL-6的表達(dá) 5 μm石蠟切片98 ℃燒烤30 min，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，0.01 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，3% H2O2于37 ℃中恒溫孵育20 min，50 μl/片正常山羊血清封閉，37 ℃恒溫孵育30 min，吸去血清，滴加50 μl兔來(lái)源多克隆IL-6抗體(稀釋比1 ∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜，室溫下復(fù)溫30～60 min，PBS洗3遍，每次5 min；滴加50 μl生物素山羊抗兔IgG工作液，37 ℃恒溫孵育10～15 min，PBS洗3遍，每次5 min，再滴加50 μl羊抗兔辣根酶標(biāo)記二抗工作液，37 ℃恒溫孵育10～15 min，PBS充分清洗后，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，光學(xué)顯徽鏡下觀(guān)察。在400倍下選取6個(gè)代表性視野，用ImagePro-Plus軟件計(jì)算每個(gè)視野中累積光密度值，求其平均值。

1.5 附睪脂肪墊基質(zhì)血管碎片(stromal vascular fraction，SVF)的提取 取新鮮附睪脂肪組織，中性PBS沖洗3次，剪成碎片，在37 ℃水浴鍋中用4 ml的1 mg/ml II型膠原酶消化40 min，200 μm過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾，1 000 r/min離心8 min，吸去上面脂肪層，2 500 r/min離心10 min，倒去上清液，底層顆粒細(xì)胞即為SVF。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SVF巨噬細(xì)胞比例 SVF細(xì)胞懸液[(1～10)×105/ml]中加入2 μl PE-抗小鼠F4/80抗體，震蕩后，常溫下避光孵育30 min，加3 ml PBS震蕩，1 500 r/min離心10 min,去除上層液體，加300 μl PBS，震蕩，Beckman Coulter流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)low Jo軟件分析巨噬細(xì)胞比例。

2 結(jié)果

2.1 飲水?dāng)z入不同濃度BPA對(duì)小鼠體重和附睪脂肪墊的影響 暴露20周后，HFD小鼠體重均高于ND小鼠，BPA暴露組ND和HFD小鼠體重和附睪脂肪墊系數(shù)均明顯高于各自對(duì)照組，且體重和附睪脂肪墊系數(shù)隨BPA濃度上升而增加。與對(duì)照組比較，ND小鼠和HFD小鼠在100 nmol/L 和1 000 nmol/L BPA處理時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同劑量BPA暴露20周對(duì)小鼠體重和附睪脂肪墊系數(shù)的影響±s)

與相同飲食對(duì)照組比較：*P<0.05

2.2 飲水?dāng)z入BPA對(duì)小鼠附睪脂肪組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的影響 與ND小鼠比較，HFD小鼠脂肪細(xì)胞體積變大，細(xì)胞間隙增大，間隙有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。與各自對(duì)照組比較，BPA處理組隨著B(niǎo)PA劑量遞增，脂肪細(xì)胞體積和細(xì)胞間隙越來(lái)越大，間隙炎細(xì)胞浸潤(rùn)也越來(lái)越明顯，見(jiàn)圖1。

2.3 飲水?dāng)z入BPA對(duì)小鼠脂肪組織IL-6表達(dá)的影響 免疫組化顯示，與ND小鼠比較，HFD小鼠脂肪組織IL-6表達(dá)明顯增強(qiáng)；與各自對(duì)照組比較，BPA處理組隨著B(niǎo)PA劑量遞增，IL-6表達(dá)逐漸增強(qiáng)，見(jiàn)圖2。

2.4 飲水?dāng)z入BPA對(duì)小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞比例的影響 流式細(xì)胞術(shù)分析附睪脂肪墊巨噬細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示，與ND小鼠比較，HFD小鼠附睪脂肪墊巨噬細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05,表中未顯示)。與各自對(duì)照組比較，在ND小鼠和HFD小鼠中BPA暴露組巨噬細(xì)胞比例都明顯升高，且均隨BPA劑量的升高而上升， ND小鼠和HFD小鼠在100 nmol/L 和1 000 nmol/L BPA處理時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

3 討論

BPA是一種典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫等情況下，容易從塑料制品中釋放出來(lái)，通過(guò)消化道、呼吸道或皮膚等多種途徑進(jìn)入人體[10]。本研究小鼠采用飲水?dāng)z入的方法暴露BPA，與人類(lèi)的暴露途徑相似。美國(guó)環(huán)保署規(guī)定BPA的安全劑量為50 μg/(kg·d)，許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都已經(jīng)證實(shí)了低于這劑量的BPA仍然可以引起機(jī)體副作用。本研究BPA暴露最高劑量為1 000 nmol/L，即228.29 μg/L,如果小鼠每天飲水量為5 ml，也只有0.114 15 μg，遠(yuǎn)低于規(guī)定的安全劑量。

表2 BPA暴露對(duì)小鼠SVF巨噬細(xì)胞比例的影響±s)

與相同飲食對(duì)照組比較：*P<0.05

圖1 各組脂肪組織染色結(jié)果 HE×400

A:ND對(duì)照組;B:10 nmol/L BPA+ND組;C:100 nmol/L BPA+ND組;D:1 000 nmol/L BPA+ND組;E:HFD對(duì)照組;F:10 nmol/L BPA+HFD組;G:100 nmol/L BPA+HFD組;H:1 000 nmol/L BPA+HFD組

圖2 免疫組化法檢測(cè)各組小鼠附睪脂肪組織IL-6表達(dá) ×400

A:ND對(duì)照組;B:10 nmol/L BPA+ND組;C:100 nmol/L BPA+ND組; D:1 000 nmol/L BPA+ND組;E:HFD對(duì)照組;F:10 nmol/L BPA+HFD組;G:100 nmol/L BPA+HFD組;H:1 000 nmol/L BPA+HFD組

許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)研究[2-4]都已經(jīng)證明BPA可以引起肥胖。肥胖機(jī)體中常常表現(xiàn)出大量脂肪組織巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn),而巨噬細(xì)胞的不斷聚集、激活，增加脂肪組織中炎癥因子的分泌，是肥胖誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生慢性低度炎癥和進(jìn)一步發(fā)展為胰島素抵抗以及代謝綜合征的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6]。故研究BPA引起肥胖小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞的聚集可以為其闡明BPA誘導(dǎo)肥胖的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

本研究結(jié)果顯示長(zhǎng)期低劑量BPA暴露在ND小鼠和HFD小鼠中都可以引起體重和附睪脂肪墊系數(shù)的升高，且隨BPA暴露劑量的升高而上升；HE染色病理觀(guān)察顯示附睪脂肪組織中脂肪細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞間隙明顯增大，且存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，與BPA暴露劑量相關(guān)；免疫組化顯示脂肪組織炎性因子IL-6的表達(dá)在BPA組較對(duì)照組顯著升高；這些結(jié)果均表明低劑量BPA暴露在ND小鼠和HFD小鼠中，都可能引起小鼠體重增加，脂肪組織出現(xiàn)炎癥狀態(tài)，在HFD小鼠中尤為明顯。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)附睪脂肪組織中巨噬細(xì)胞的比例顯示BPA暴露可導(dǎo)致脂肪組織巨噬細(xì)胞的比例明顯升高，且與BPA劑量相關(guān)，與體重和炎癥趨勢(shì)相似，表明BPA誘導(dǎo)肥胖中脂肪組織巨噬細(xì)胞發(fā)生明顯的聚集，且脂肪組織巨噬細(xì)胞的聚集可能在肥胖的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

綜上所述，低劑量BPA長(zhǎng)期暴露可誘導(dǎo)小鼠肥胖，而脂肪組織巨噬細(xì)胞的聚集可能與肥胖的發(fā)生機(jī)制相關(guān)；而B(niǎo)PA暴露介導(dǎo)脂肪組織巨噬細(xì)胞聚集的機(jī)制以及不同巨噬細(xì)胞亞型在BPA誘導(dǎo)肥胖中的作用是進(jìn)一步研究的方向。

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Accumulation of adipose tissue macrophages in obese mice induced by bisphenol A

Li Yingpei，Luo Shimeng，Leng Yinzhi，et al

(DeptofHealthToxicology,SchoolofPublicHealth,AnhuiMedicalUniversity，Hefei230032)

Objective To investigate the accumulation of macrophages in the adipose tissue from the obese mice induced by low-dose bisphenol A (BPA) intake through potable water. Methods Four-week C57BL/6 male mice were randomly divided into normal diet (ND) group and high fat diet (HFD) group. Each group was further divided into vehicle control, 10 nmol/L BPA, 100 nmol/L BPA and 1 000 nmol/L BPA group. Mice were exposed to BPA through drinking water. After 20 weeks, mice were weighed and sacrificed. The epididymis fat pad was obtained under sterile conditions. The infiltration of inflammatory cells in adipose tissues were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining. IL-6 expression in adipose tissues was detected by immunohistochemistry. The proportion of macrophages in stromal vascular fractions (SVF) was analyzed by flow cytometry. Results In ND and HFD groups, the body weight and coefficients of epididymis fat pad in BPA exposed mice were significantly increased compared with the corresponding control, and as a dose-dependent manner. The volumes of adipocytes and gap between adipocytes were exaggerated. Infiltration of inflammatory cells in adipose tissue was observed in BPA treated mice. In addition, BPA exposure upregulated IL-6 expression in adipose tissue and elevated the percentages of macrophages in SVF. Conclusion Low-dose BPA exposure can induce obesity in mice, which is associated with the accumulation of macrophages in adipose tissue.

bisphenol A; inflammation; adipose tissue macrophages

時(shí)間：2016-8-10 11:04:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.015.html◇預(yù)防醫(yī)學(xué)研究◇

2016-05-30接收

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81473015)；安徽省自然科學(xué)基金(編號(hào)：1508085MH161)；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：AH201410366103)

安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院1衛(wèi)生毒理學(xué)系、2012級(jí)食品質(zhì)量與安全專(zhuān)業(yè)、4職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，合肥 23003

3安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科，合肥 230022

李應(yīng)配，男，碩士研究生；

沈 彤，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:ahmusht@163.com

R 114

A

1000-1492(2016)10-1464-04

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.015