王 鑫，陳曉蓉

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成年裸鼠與野生型小鼠皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)及表皮干細胞標志物分布、表達量的比較研究

王 鑫，陳曉蓉

目的 比較成年裸鼠與野生型小鼠皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)及表皮干細胞標志物p63、角蛋白19和β1整合素的分布和表達量的差異，為后續(xù)的皮膚組織工程學(xué)研究提供客觀的參照。方法 分別取8只成年裸鼠與野生型小鼠背部皮膚，制作石蠟切片，進行HE染色，光鏡下觀察皮膚表皮、真皮和皮膚附屬器的形態(tài)結(jié)構(gòu)；免疫組織化學(xué)法檢測p63、角蛋白19和β1整合素在兩種鼠皮膚的分布和表達量。結(jié)果 HE染色低倍鏡下裸鼠表皮較野生型小鼠厚，高倍鏡下裸鼠表皮由3～4層上皮細胞組成，而野生型小鼠表皮由1～2層上皮細胞組成。裸鼠表皮基底層細胞呈立方形或者矮柱形，細胞核深染，呈卵圓形，居中，野生型小鼠表皮基底層細胞呈立方形，細胞核圓形深染。裸鼠表皮有明顯的顆粒層，而野生型小鼠表皮則無。裸鼠皮脂腺沒有野生型小鼠皮脂腺發(fā)達；免疫組織化學(xué)顯示p63表達于裸鼠和野生型小鼠毛囊和表皮基底層細胞的胞核中，角蛋白19表達于裸鼠和野生型小鼠皮膚毛囊和基底層細胞中，β1整合素表達于裸鼠皮膚毛囊和表皮顆粒層細胞中及野生型小鼠毛囊中；裸鼠p63、β1整合素和角蛋白19的表達量少于野生型小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 成年裸鼠與野生型小鼠皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)及表皮干細胞標志物的分布和表達量存在差異，可以作為區(qū)別裸鼠與野生型小鼠皮膚的參考。

比較組織學(xué)；免疫組織化學(xué)；表皮干細胞

裸鼠目前是生物醫(yī)學(xué)研究不可或缺的模型鼠，除應(yīng)用于腫瘤學(xué)、毒理學(xué)、藥品和生物制品安全性評價和篩選的研究中[1]，又因與野生型小鼠相比，存在免疫缺陷，可以作為移植皮膚的受體，廣泛應(yīng)用于皮膚組織工程學(xué)研究中，并可用此模型研究相關(guān)皮膚疾病的病因及發(fā)生發(fā)展[1-2]。該研究將對裸鼠和野生型小鼠的皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)進行細致觀察，通過對表皮干細胞標志物p63、角蛋白19及β1整合素[3]進行標記，觀察3種標志物在裸鼠和野生型小鼠皮膚的分布及計算其表達量并進行統(tǒng)計分析，探討兩者存在的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取8周齡健康SPF級成年裸鼠(Balb/c-nu)，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，雌雄不限，19～21 g、安徽動物實驗中心21～23 ℃室溫無菌條件下飼養(yǎng)，飼料和水均消毒滅菌，飼養(yǎng)1周后處死。選取8周齡健康SPF級昆明野生型小鼠，購自安徽省動物實驗中心，雌雄不限，15～18 g，自由采食，飼養(yǎng)1周后處死。本實驗在處理動物過程中遵循安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理章程。

1.2 主要儀器與試劑 RM2135石蠟切片機(德國LEICA公司)；BM-Ⅱ石蠟包埋機(安徽電力科學(xué)研究所)；日本OLYMPUS顯微鏡BX53(日本OLYMPUS公司)；85-1恒溫磁力攪拌器(常州國華電器有限公司)；ZT-12P 型生物組織自動脫水機(湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)；QP-B1 型切片漂烘溫控儀(安徽電子科學(xué)研究所)；4 ℃～-20 ℃冰箱(合肥美菱冰箱廠)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(美國 Media Cybernetics公司)；兔抗鼠p63(ab109126)、角蛋白19(ab52625)和β1整合素(ab52971)抗體購自美國Abcam公司；二抗檢測試劑盒(PV-6001)、DAB顯色劑(ZLI-9018)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 取材和制作切片 ① HE染色：取裸鼠和野生型小鼠背部皮膚，10%甲醛溶液固定、脫水、透明、包埋、切片、烤片、脫蠟復(fù)水、HE染色、封片，觀察結(jié)果；② 免疫組織化學(xué)染色：取裸鼠和野生型小鼠背部皮膚，10%甲醛溶液固定，脫水、透明、包埋、切片、烤片、脫蠟復(fù)水后放檸檬酸鹽液中，微波爐中高火進行抗原熱修復(fù)，雙氧水孵育，分別加入一抗，4 ℃過夜，滴加二抗，室溫靜置1 h，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片，觀察結(jié)果。

1.4 圖像分析 Nikon DXM1200F 400倍鏡下攝像，采用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0測算3種標志物陽性表達的累積光密度，再除以選定面積，算出平均光密度(mean optical density, MOD)值，MOD值越大，標志物表達量越多。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 裸鼠和野生型小鼠皮膚經(jīng)HE染色結(jié)果顯示均由表皮、真皮和皮下組織構(gòu)成。低倍鏡下裸鼠表皮明顯厚于野生型小鼠。裸鼠和野生型小鼠的表皮與真皮連接處結(jié)構(gòu)比較相似，都相對平整。裸鼠和野生型小鼠的皮下組織中均可見縱切橫紋肌(M)，見圖1A、1D。

高倍鏡下裸鼠表皮由3～4層上皮細胞組成，而野生型小鼠表皮由1～2層上皮細胞組成，兩者在基底細胞和基底上層細胞有形態(tài)學(xué)差異，裸鼠基底層細胞(圖1B黃色箭頭所指)呈立方形或者柱狀，細胞核深染，呈卵圓形，居中；野生型小鼠基底層細胞(圖1E藍色箭頭所指)呈立方形，細胞核圓形深染?；咨蠈蛹毎闶笥忻黠@的顆粒層，但細胞輪廓不清晰，可見濃染顆粒，而野生型小鼠沒有，裸鼠真皮膠原纖維(CF)(圖1B、1E)豐富，較野生型小鼠發(fā)達。

裸鼠毛囊(HF)染色較深，毛根(HR)發(fā)育不良，與毛囊融為一體，無突出表皮的毛干；而野生型小鼠毛囊染色較淺，毛根發(fā)育正常，毛干突出表皮，同時裸鼠和野生型小鼠均未見立毛肌和汗腺結(jié)構(gòu)。見圖1A、1D。

野生型小鼠皮脂腺較裸鼠皮脂腺發(fā)達。高倍鏡下顯示裸鼠皮脂腺細胞細胞質(zhì)染色略深，核較大，染色略深，可見雙核結(jié)構(gòu)，細胞腺體周邊的細胞與中心的細胞差別不大。野生型小鼠皮脂腺細胞胞質(zhì)染色較淺，核小，且腺體細胞形態(tài)由腺體外周向腺體中心呈漸進性固縮狀態(tài)。見圖1C、1F。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果 p63表達于裸鼠和野生型小鼠毛囊和表皮基底層細胞的胞核中，角蛋白19表達于裸鼠和野生型小鼠皮膚毛囊和基底層細胞中，β1整合素表達于裸鼠皮膚毛囊和表皮顆粒層細胞中及野生型小鼠毛囊中，裸鼠p63、β1整合素和角蛋白19的表達量少于野生型小鼠(P<0.01)。見圖2、表1。

表1 成年裸鼠與野生型小鼠p63、角蛋白19、β1整合素MOD值的比較

圖1 HE染色示裸鼠及野生型小鼠皮膚

A、B、C：裸鼠皮膚；D、E、F：野生型小鼠皮膚；HF：毛囊；HR：毛根；EP：表皮；CF：膠原纖維；M：橫紋??；SG：皮脂腺；N：細胞核；A、D：×100；B、C、E、F：×400

圖2 免疫組織化學(xué)染色示裸鼠及野生型小鼠皮膚 ×400

3 討論

研究[4]表明野生型小鼠由于有豐密的毛發(fā)作為保護層，大大減弱了環(huán)境對其造成的表皮磨損，本實驗結(jié)果表明裸鼠體表光滑，其表皮較野生型小鼠厚，可能是為了應(yīng)對皮膚在環(huán)境中受到的磨損，保護自身免受傷害，皮膚相應(yīng)增厚，而真皮作為向表皮提供營養(yǎng)來源的結(jié)構(gòu)，為了給相對較厚的表皮提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，結(jié)構(gòu)相應(yīng)增厚；動物模型表皮較薄，顆粒層不連續(xù)甚至缺如。本研究結(jié)果表明，裸鼠表皮含有一層顆粒層細胞，細胞輪廓不清晰，HE染色可見濃染藍色顆粒，而野生型小鼠則沒有顆粒層細胞，說明裸鼠由于環(huán)境的影響，產(chǎn)生了與人類皮膚類似的顆粒層，增強了皮膚抵抗外來損害的能力。

研究[4]表明，不同動物之間的皮脂腺結(jié)構(gòu)和腺細胞形態(tài)結(jié)果一般差別不大。本研究顯示，與裸鼠皮脂腺相比，野生型小鼠皮脂腺較為發(fā)達，說明野生型小鼠皮脂腺細胞分化較為成熟，而裸鼠皮脂腺細胞核大，細胞有的具有雙核，其成熟程度低于野生型小鼠。主要原因可能是裸鼠作為常用的實驗動物，在人工的飼養(yǎng)環(huán)境中其生活環(huán)境單一，導(dǎo)致了皮脂腺的退化。動物毛發(fā)對保護皮膚免受損害有重要作用，毛由伸出皮外的毛干和埋入皮膚中的毛根構(gòu)成[4-5]。本研究 HE 染色結(jié)果顯示，裸鼠毛囊染色較深，毛根發(fā)育不良，導(dǎo)致毛干不能突出表皮，使裸鼠呈現(xiàn)光滑無毛狀態(tài)，具體原因有待實驗一步探究。

研究[6-8]表明，從角膜和皮膚組織中分離得到了表皮細胞，通過檢測其p63的表達和克隆形成能力，發(fā)現(xiàn)在全克隆細胞中p63高表達，而亞克隆細胞則不表達，因此p63可作為區(qū)分表皮干細胞和其他體細胞的標記基因。p63的缺失可直接導(dǎo)致表皮基底層干細胞缺乏。本實驗結(jié)果顯示p63表達于裸鼠和野生型小鼠毛囊和基底層細胞的胞核中，但是裸鼠p63的表達量少于野生型小鼠，可能原因是野生型小鼠表皮干細胞的活力較裸鼠高。

研究[9-11]表明β1整合素在表皮基底層部分細胞中表達，β1整合素是層黏連蛋白和膠原蛋白受體，這些細胞能夠通過Ⅳ型膠原快速科學(xué)儀黏附法進行富集，并有全克隆生長特點，因此β1整合素可以作為表皮干細胞的標志物。本研究結(jié)果顯示β1整合素在裸鼠毛囊和表皮顆粒層均有表達，而在野生型小鼠皮膚中僅僅表達在毛囊中，表明在裸鼠和野生型小鼠毛囊間表皮干細胞并不表達β1整合素，但β1整合素作為表皮干細胞的標志物為何會表達在裸鼠顆粒層，有待進一步探究。本研究顯示在裸鼠毛囊和表皮顆粒層細胞中表達的β1整合素量少于野生型小鼠毛囊中的β1整合素的表達量，推測野生型小鼠表皮中的細胞總體的增殖能力要強于裸鼠，由于野生型小鼠的皮膚較薄，細胞庫的細胞基數(shù)較小，為保證毛發(fā)的完整以及質(zhì)量，因此表皮細胞需要保持較高的活力來為細胞更新?lián)Q代。

研究[12]表明[3H]胸苷標記滯留的細胞被鑒別為表皮干細胞，在毛囊外根鞘區(qū)應(yīng)用免疫酶雙標法同時標記[3H]胸苷和角蛋白19，發(fā)現(xiàn)[3H]胸苷陽性細胞同時表達角蛋白19，表明角蛋白19是毛囊干細胞的一種標志物。本研究結(jié)果顯示角蛋白19表達于裸鼠和野生型小鼠皮膚毛囊和基底層細胞中，表明裸鼠和野生型小鼠皮膚中角蛋白19的分布無差異，但是野生型小鼠角蛋白19表達量要比裸鼠高，可能原因是裸鼠毛囊發(fā)育不良，導(dǎo)致裸鼠角蛋白19表達低于野生型小鼠。相比裸鼠，野生型小鼠表皮較薄，角質(zhì)層上的鱗屑在環(huán)境中流失快，需要更牢固的連接，角蛋白19需要有較高的表達。

裸鼠和野生型小鼠作為動物模型廣泛應(yīng)用于各種實驗中[1]，因此比較裸鼠和野生型小鼠皮膚的差異，有利于動物實驗?zāi)Ｐ偷慕⒑蛣?chuàng)新，促進動物實驗向臨床方向轉(zhuǎn)化；此外裸鼠和野生型小鼠在皮膚表皮、真皮及附屬器的形態(tài)和3種表皮干細胞標記物表達的差異反映了兩種表型小鼠的皮膚在生長發(fā)育過程中基因表達及調(diào)控的不同，究竟是哪些基因在生長發(fā)育過程中表達不同，需要進一步的探索和研究。

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The comparative study of skin morphological structure and epithelial stem cell markers expression distribution, quantity between adult nude mice and wild-type mice

Wang Xin,Chen Xiaorong

(DeptofHistologyandEmbryology，SchoolofBasicMedicalScience，AnhuiMedicalUniversity，Hefei230032)

ObjectiveTocomparethedifferencesofskinmorphologicalstructureandthedistribution,quantityofepithelialstemcellmarkersexpressionbetweenadultnudemiceandwild-typemice，andtoprovideanobjectivereferenceforsubsequentstudyofskintissueengineering.MethodsThedorsalskinwasobtainedfrom8adultnudemiceandwild-typemicerespectivelytomakeparaffinsections.Thenthemorphologyofepidermis,dermisandskinappendageswereobservedbyHEstainingunderlightmicroscope.Distributionandquantityofp63,β1integrinandkeratin19expressionweredeterminedbyimmunohistochemicalstaininginskin.ResultsTheepidermisofnudemicewasthickerthanthatofwild-typemiceunderlightmicroscopeatlowmagnification.Athighmagnification,epidermisofnudemiceconsisted3to4layersofepithelialcells,whilethatofwild-typemiceconsisted1to2layersofepithelialcells.Thecellsinstratumbasaleofnudemicewerecuboidalorshort-columnedandhadhyperchromaticovalnucleirestingatthecenterofcells,whereasinstratumbasaleofwild-typemice,theywereroundandthenucleiwerehyperchromaticandround.Thereexistedobviousstratumgranulosumintheepidermisofnudemice,whereastherewasnostratumgranulosumintheepidermisofwild-typemice.Thesebaceousglandsoftheadultnudemicewerelessdevelopedthanthatofwild-typemice.Immunohistochemistrystainingshowedthatp63wasexpressedinnucleiofstratumbasalandhairfolliclescellsofnudemiceandwild-typemice,keratin19instratumbasalandinhairfolliclescellsofnudemiceandwildtypemice,β1integrininstratumgranulosumlayerandhairfolliclescellsofnudemice,andinthehairfolliclescellsofwild-typemice.Thequantitiesofp63,keratin19,β1integrinexpressionofthenudemicewerelowerthanthatofwild-typemice,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.01).ConclusionThereexistdifferencesofskinmorphologicalstructureandthedistribution,quantityofepithelialstemcellmarkersexpressionthatcanbeas

fordistinguishingthetypeofskinbetweenadultnudemiceandwild-typemice.

comparativemorphology;immunohistochemistry;epithelialstemcell

時間：2016-8-10 11:04:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.014.html

2016-07-14接收

安徽省教育廳基金項目(編號：KJ2007A034)

安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，合肥 230032

王 鑫，男，碩士研究生；

陳曉蓉，女，教授，碩士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：chenxrzp@126.com

R 318.08

A

1000-1492(2016)10-1459-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.014