衛(wèi) 潔，馮世堯，徐興欣，吳永貴

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TAK1抑制劑對(duì)高糖環(huán)境巨噬細(xì)胞和系膜細(xì)胞相互作用的影響及機(jī)制

衛(wèi) 潔，馮世堯，徐興欣，吳永貴

目的 探討高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1(TAK1)抑制劑5Z-7-oxozeaenol在巨噬細(xì)胞和系膜細(xì)胞相互關(guān)系中的作用。方法 巨噬細(xì)胞和系膜細(xì)胞共培養(yǎng)、巨噬細(xì)胞單培養(yǎng)、系膜細(xì)胞單培養(yǎng)3種培養(yǎng)方式分別分為：抑制劑對(duì)照組、甘露醇對(duì)照組、正常對(duì)照組、高糖組、高糖+不同濃度(30、100、300 nmol/L)抑制劑組。采用Western blot法檢測(cè)單培養(yǎng)巨噬細(xì)胞p-TAK1、TAK1結(jié)合蛋白(TAB1)、NF-κB p65蛋白表達(dá)變化，免疫熒光檢測(cè)TAK1抑制劑對(duì)NF-κB p65亞基核轉(zhuǎn)位的影響。采用ELISA法檢測(cè)單培養(yǎng)和共培養(yǎng)各組細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、單核細(xì)胞趨化因子(MCP)-1、Ⅳ型膠原(Col Ⅳ)、纖維連接蛋白(FN)含量變化，光鏡下觀察共培養(yǎng)對(duì)巨噬細(xì)胞遷移能力影響。結(jié)果 與對(duì)照組比較，高糖刺激巨噬細(xì)胞p-TAK1、TAB1、NF-κB p65蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05)， 高糖組共培養(yǎng)和單培養(yǎng)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、MCP-1、

TAK1；共培養(yǎng)；糖尿病腎??；炎癥；纖維化

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一,目前認(rèn)為炎癥貫穿DN病理過(guò)程的每個(gè)階段。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1(TGF-β activated kinase-1，TAK1)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。已被證明是參與腎纖維化和炎性反應(yīng)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子[1]。對(duì)該通路進(jìn)行干預(yù)可能為延緩DN進(jìn)展提供新思路。5Z-7-oxozeaenol是TAK1特異性抑制劑，研究[2]表明5Z-7-oxozeaenol能明顯抑制高糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，發(fā)揮抗炎效應(yīng)。該研究通過(guò)構(gòu)建巨噬細(xì)胞和系膜細(xì)胞共培養(yǎng)模型，更好地模擬DN患者體內(nèi)腎小球病理環(huán)境，從而觀察巨噬細(xì)胞和系膜細(xì)胞相互作用對(duì)炎癥因子和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)產(chǎn)生的影響。并以不同濃度5Z-7-oxozeaenol作為干預(yù)因素，進(jìn)一步觀察其在高糖環(huán)境、共培養(yǎng)條件下，對(duì)細(xì)胞形態(tài)和功能的影響，以期從細(xì)胞間相互作用角度探討TAK1通路在DN發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 6～ 8周齡、SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠，15～20 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞株和小鼠腎小球系膜細(xì)胞sv40 MES 13細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞庫(kù))；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(加拿大Wisent公司)；BCA蛋白測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒(江蘇碧云天公司)；Transwell小室、TAK1抑制劑5Z-7-oxozeaenol(美國(guó)Millipore公司)；D-葡萄糖(美國(guó)Sigma公司)；兔抗TAK1、兔抗p-TAK1、兔抗TAK1結(jié)合蛋白(TAK1 binding protein, TAB1)多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；兔抗NF-κB p65多克隆抗體(美國(guó)CST公司)；小鼠抗β-action單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(武漢三鷹公司)；Alexa Fluor?647 標(biāo)記的F4/80抗體(美國(guó) Santa Cruz公司)；小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、Ⅳ型膠原(collagen Ⅳ , Col Ⅳ)、纖維連接蛋白(fibronectin, FN) ELISA試劑盒(美國(guó)R&D公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1.1 提取骨髓原代巨噬細(xì)胞 小鼠采用頸椎脫臼法處死，75%酒精浸泡5 min，用剪刀分離完整的股骨和脛骨，置于70%酒精浸泡5 min后移入超凈臺(tái)。無(wú)菌操作下剪斷兩側(cè)干骺端，用21G的注射器針頭插入骨髓腔內(nèi)，用含2%胎牛血清(FBS)的冷PBS反復(fù)沖洗制成單細(xì)胞懸液，過(guò)篩、裂紅、離心，棄上清液，用含有15% L929上清液、10% FBS、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106細(xì)胞/L，接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于5% CO2、37 ℃恒溫孵箱中培養(yǎng)，第7天收集貼壁細(xì)胞。

1.2.1.2 系膜細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 將凍存的系膜細(xì)胞從液氮罐中取出，放入37 ℃水浴鍋中速融，轉(zhuǎn)移至離心管中加5 ml培養(yǎng)液反復(fù)吹打重懸，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，再加5 ml培養(yǎng)液重懸后，接種至含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.1.3 構(gòu)建共培養(yǎng)模型 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞和系膜細(xì)胞，應(yīng)用Transwell小室和6孔培養(yǎng)板組建共培養(yǎng)裝置。將兩種細(xì)胞用0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，系膜細(xì)胞以4×105個(gè)/孔接種至Transwell小室中位于共培養(yǎng)模型上層，巨噬細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種至普通6孔板中位于共培養(yǎng)模型底層，分別培養(yǎng)兩種細(xì)胞至完全貼壁，將Transwell小室插入6孔培養(yǎng)板中共培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，換用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基同步12 h后，進(jìn)行以下分組。

1.2.2 細(xì)胞分組 培養(yǎng)方式分為巨噬細(xì)胞和系膜細(xì)胞共培養(yǎng)、巨噬細(xì)胞單培養(yǎng)、系膜細(xì)胞單培養(yǎng)3種，每種培養(yǎng)方式按培養(yǎng)條件分7組：抑制劑對(duì)照組：RPMI 1640培養(yǎng)基+300 nmol/L 5Z-7-oxozeaenol；甘露醇對(duì)照組：含25 mmol/L甘露醇的RPMI 1640培養(yǎng)基；正常對(duì)照組：RPMI 1640培養(yǎng)基；高糖組：含33 mmol/L[3]葡萄糖RPMI 1640培養(yǎng)基；高糖+抑制劑組(HG+OZ30、100、300)：含33 mmol/L葡萄糖RPMI 1640培養(yǎng)基+不同濃度(30、100、300 nmol/L)的5Z-7-oxozeaenol(OZ30、100、300)。各組均培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞上清液，-70 ℃凍存待測(cè)，每組均重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)單培養(yǎng)巨噬細(xì)胞p-TAK1、TAB1、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平 收集各組巨噬細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每個(gè)蛋白樣品取40 μg上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳，條件：積層膠55 V恒壓泳30 min，分離膠110 V、70 min。350 mA恒流轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜(NC膜)上約60 min，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)印效率，5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h。分別加入TAK1(1 ∶1 000)，p-TAK1(1 ∶1 000)，TAB1(1 ∶1 000)，NF-κB p65(1 ∶1 000)，β-actin(1 ∶8 000)，4 ℃過(guò)夜，TBST洗3次，每次10 min，加入對(duì)應(yīng)二抗(1 ∶8 000)，37 ℃孵育45 min，洗膜、顯色，以β-actin作為內(nèi)參，利用系統(tǒng)軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.4 免疫熒光觀察NF-κB p65核轉(zhuǎn)位 收集成熟巨噬細(xì)胞于共聚焦專(zhuān)用Petri皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定，透膜，5%驢血清37 ℃封閉2 h，加入以1 ∶100比例稀釋的兔抗小鼠NF-κB p65一抗，4 ℃過(guò)夜，PBST漂洗3次，每次10 min，加入Alexa Fluor?647標(biāo)記的F4/80和FITC標(biāo)記的驢抗兔IgG二抗(1 ∶1 000)，常溫避光孵育2 h，DAPI染核，封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采像。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、MCP-1、Col Ⅳ、FN含量 收集單培養(yǎng)與共培養(yǎng)各組細(xì)胞上清液，快速離心10 min。嚴(yán)格參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)量吸光度(optical density,OD)值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本實(shí)際濃度。每組重復(fù)3次。

1.2.6 Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建共培養(yǎng)模型，上室接種巨噬細(xì)胞，下室接種系膜細(xì)胞，分別設(shè)抑制劑對(duì)照組、正常對(duì)照組、高糖組、高糖+OZ300組，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，PBS洗3次，棉簽擦去上室內(nèi)表面未遷移的巨噬細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，晾干后用HE常規(guī)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，以與正常對(duì)照組的倍數(shù)比作為結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度5Z-7-oxozeaenol對(duì)單培養(yǎng)巨噬細(xì)胞p-TAK1、TAB1、NF-κB p65蛋白表達(dá)影響 在巨噬細(xì)胞單培養(yǎng)條件下，Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，巨噬細(xì)胞經(jīng)33 mmol/L葡萄糖刺激，p-TAK1、TAB1、NF-κB p65蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，而與高糖組比較，5Z-7-oxozeaenol呈濃度依賴(lài)性降低p-TAK1、TAB1、NF-κB p65蛋白表達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 免疫熒光觀察5Z-7-oxozeaenol對(duì)高糖刺激巨噬細(xì)胞NF-κB p65亞基入核的影響 對(duì)照組中，NF-κB p65熒光標(biāo)記(綠色)幾乎均分布于胞質(zhì)區(qū)，高糖組可見(jiàn)NF-κB p65熒光標(biāo)記主要分布于胞核區(qū)，說(shuō)明高糖刺激可使熒光標(biāo)記的NF-κB p65由胞質(zhì)區(qū)轉(zhuǎn)入胞核區(qū)，而經(jīng)300 nmol/L的5Z-7-oxozeaenol干預(yù)，NF-κB p65入核明顯減少。見(jiàn)圖2。

2.3 共培養(yǎng)條件下對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響 單培養(yǎng)和共培養(yǎng)條件下均顯示，與對(duì)照組比較，高糖刺激均可引起細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量升高(P<0.05)。單培養(yǎng)和共培養(yǎng)比較，共培養(yǎng)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量較單培養(yǎng)升高更明顯(P<0.05)。5Z-7-oxozeaenol呈濃度依賴(lài)性降低TNF-α、IL-1β、MCP-1分泌， 300 nmol/L的5Z-7-oxozeaenol對(duì)高糖刺激炎癥因子分泌的抑制作用最強(qiáng)(P<0.05)。見(jiàn)表1～3。

圖1 5Z-7-oxozeaenol干預(yù)對(duì)高糖刺激巨噬細(xì)胞TAK1、TAB1、NF-κB p65表達(dá)的影響

A：抑制劑對(duì)照組；B：甘露醇對(duì)照組；C：正常對(duì)照組；D：高糖組；E：高糖+OZ30組；F：高糖+OZ100組；G：高糖+OZ300組；與正常對(duì)照組比較：*P<0.05；與高糖組比較：#P<0.05

2.4 共培養(yǎng)條件下對(duì)ECM成分產(chǎn)生的影響 單培養(yǎng)系膜細(xì)胞和共培養(yǎng)條件下均顯示，高糖刺激均可引起細(xì)胞上清液中Col Ⅳ、FN含量升高(P<0.05)，而共培養(yǎng)較單培養(yǎng)系膜細(xì)胞升高的更明顯(P<0.05)。5Z-7-oxozeaenol呈濃度依賴(lài)性減少Col Ⅳ、FN分泌，300 nmol/L的5Z-7-oxozeaenol對(duì)高糖環(huán)境中系膜細(xì)胞ECM成分分泌的抑制作用最強(qiáng)(P<0.05)。見(jiàn)表4、5。

表1 各組上清液中TNF-α含量

與正常對(duì)照比較：*P<0.05；與高糖組比較：#P<0.05；與共培養(yǎng)比較：△P<0.05

圖2 5Z-7-oxozeaenol對(duì)高糖刺激巨噬細(xì)胞NF-κB p65亞基入核的影響 ×200 F4/80(紅光)：巨噬細(xì)胞；NF-κB p65(綠光)：NF-κB p65；DAPI(藍(lán)光)：細(xì)胞核;Merge:合并

項(xiàng)目抑制劑對(duì)照組甘露醇對(duì)照組正常對(duì)照組高糖組高糖+OZ30組高糖+OZ100組高糖+OZ300組F值單培養(yǎng)巨噬細(xì)胞55．42±8．3550．57±11．8956．34±4．01115．15±21．87?△113．98±17．94?△91．08±8．4082．09±12．12#90．37單培養(yǎng)系膜細(xì)胞54．38±7．0054．07±10．1750．02±11．72240．09±43．44?△229．72±58．00?△120．26±8．10#100．64±27．47#78．91共培養(yǎng)53．59±7．3455．81±7．8753．92±9．37275．61±34．65?262．79±45．69?193．51±39．64#136．67±24．71#142．89

與正常對(duì)照比較：*P<0.05；與高糖組比較：#P<0.05；與共培養(yǎng)比較：△P<0.05

表3 各組上清液中MCP-1含量

與正常對(duì)照比較：*P<0.05；與高糖組比較：#P<0.05；與共培養(yǎng)比較：△P<0.05

表4 各組上清液中Col-Ⅳ含量

與正常對(duì)照比較：*P<0.05；與高糖比較：#P<0.05；與單培養(yǎng)系膜細(xì)胞比較：△P<0.05

表5 各組上清液中FN含量

與正常對(duì)照比較：*P<0.05；與高糖組比較：#P<0.05；與單培養(yǎng)系膜細(xì)胞比較：△P<0.05

2.5 TAK1抑制劑對(duì)巨噬細(xì)胞遷移的影響 Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，高糖刺激巨噬細(xì)胞遷移到小室外側(cè)的數(shù)目顯著增加(P<0.05)，300 nmol/L的5Z-7-oxozeaenol干預(yù)后，巨噬細(xì)胞遷移數(shù)目明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 5Z-7-oxozeaenol干預(yù)對(duì)巨噬細(xì)胞遷移的影響 ×100

A：抑制劑對(duì)照組；B：正常對(duì)照組；C：高糖組；D：高糖+OZ300組；與正常對(duì)照組比較：*P<0.05；與高糖組比較：#P<0.05

3 討論

DN是一種慢性炎癥性疾病,其主要表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞聚集、腎小球肥大、基底膜增厚、ECM增加和腎纖維化，最終導(dǎo)致腎功能喪失。體內(nèi)高糖微環(huán)境是公認(rèn)的DN始發(fā)因素，可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，促使糖基化終末產(chǎn)物、多元醇代謝通路和蛋白激酶C通路過(guò)度激活，從而加速腎臟損傷[4]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示高糖刺激可分別誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和系膜細(xì)胞TNF-α、IL-1β、MCP-1分泌增加，共同驗(yàn)證了高糖是誘發(fā)炎癥反應(yīng)的重要因素。據(jù)報(bào)道，TNF-α和MCP-1是反映慢性腎臟病進(jìn)展程度的重要指標(biāo)，在2型DN患者尿液中檢測(cè)到TNF-α、MCP-1水平異常升高，且TNF-α升高程度與尿白蛋白排泄水平呈顯著正相關(guān)性[5]；MCP-1升高水平與糖化血紅蛋白(HbA1C)、尿蛋白/尿肌酐比值(ACR)和血肌酐水平呈正相關(guān)性，與腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)呈顯著負(fù)相關(guān)性[6]。抑制炎癥因子的分泌可能一定程度上延緩DN的進(jìn)展，TAK1作為調(diào)節(jié)多種促炎因子信號(hào)通路的中心環(huán)節(jié)，參與了調(diào)亡、免疫炎癥反應(yīng)和纖維化等多種病理生理過(guò)程，5Z-7-oxozeaenol呈劑量依賴(lài)性降低上述炎癥因子的表達(dá)。

研究[7]表明，高糖刺激巨噬細(xì)胞后p-TAK1和TAB1表達(dá)均較對(duì)照組明顯上調(diào)，單獨(dú)TAK1并不能產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，只有以TAK1-TAB1復(fù)合物形式才能發(fā)揮TAK1激酶活性，說(shuō)明高糖誘導(dǎo)TAK1-TAB1復(fù)合物活化是誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生的可能機(jī)制之一。NF-κB通路是多種炎癥反應(yīng)的共同下游通路，高糖刺激通過(guò)TAK1轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能激活I(lǐng)κB激酶，從而解除IκB的抑制作用，將p50/p65異源二聚體解離出來(lái)，移位入核，調(diào)節(jié)下游炎癥因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)[8]。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡同樣觀察到高糖刺激可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中NF-κB p65亞基發(fā)生核轉(zhuǎn)位，而5Z-7-oxozeaenol干預(yù)可同時(shí)降低NF-κB p65蛋白表達(dá)以及抑制NF-κB p65亞基入核，說(shuō)明 5Z-7-oxozeaenol抗炎效應(yīng)是由干預(yù)NF-κB通路激活部分介導(dǎo)。

腎纖維化病理基礎(chǔ)是ECM聚集，ECM成分主要包括Col Ⅳ和FN，故可將其作為反映腎纖維化程度的敏感指標(biāo)[9]。高糖刺激既可促進(jìn)系膜細(xì)胞炎癥因子的分泌，又可誘導(dǎo)ECM成分(Col Ⅳ和FN)產(chǎn)生增加，提示炎癥反應(yīng)與腎纖維化的進(jìn)程密不可分。研究[10]證實(shí)一些炎癥因子如IL-1也是強(qiáng)刺激因子，能誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增生，ECM產(chǎn)生增多，引起系膜區(qū)擴(kuò)張和基底膜破壞。高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)Col Ⅳ和FN研究[11]顯示，MCP-1與其受體CCR2結(jié)合可介導(dǎo)高糖環(huán)境中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)的表達(dá)增加，進(jìn)一步促進(jìn)ECM產(chǎn)生和積聚，最終引起腎纖維化。以上研究提示炎癥反應(yīng)是造成腎纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵因素。TAK1信號(hào)通路被證實(shí)為一條非Smads依賴(lài)途徑，可介導(dǎo)腎纖維化進(jìn)展[12]。在TGF-β1刺激小鼠系膜細(xì)胞增殖的研究[13]表明TAK1與Col Ⅰ和FN表達(dá)增加密切相關(guān)。本研究利用不同濃度5Z-7-oxozeaenol干預(yù)高糖環(huán)境中培養(yǎng)的系膜細(xì)胞后顯示，細(xì)胞上清液中Col IV和FN含量明顯降低，提示高糖刺激ECM分泌增加可能由TAK1信號(hào)通路部分介導(dǎo)。Ma et al[14]通過(guò)建立 TAK1基因缺失的單側(cè)輸尿管梗阻后腎纖維化動(dòng)物模型，同樣證實(shí)敲除TAK1能降低腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞積聚、膠原沉積和促纖維化分子表達(dá)。這些證據(jù)均提示TAK1信號(hào)通路是介導(dǎo)促炎反應(yīng)、ECM增生和腎纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究[15]表明高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖和FN表達(dá)增加與NF-κB通路激活有關(guān)。本研究通過(guò)藥物干預(yù)抑制p-TAK1表達(dá)的同時(shí)，NF-κB p65蛋白表達(dá)亦降低，推測(cè)5Z-7-oxozeaenol是通過(guò)抑制NF-κB通路活化，從而減少ECM的產(chǎn)生。

綜上所述，本研究不僅證實(shí)高濃度葡萄糖可激活TAK1-TAB1復(fù)合物、活化下游NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌。也說(shuō)明巨噬細(xì)胞與系膜細(xì)胞之間存在相互作用，能促使腎內(nèi)炎癥級(jí)聯(lián)放大，可能是導(dǎo)致DN纖維化進(jìn)展的重要原因之一。TAK1特異性抑制劑5Z-7-oxozeaenol通過(guò)干預(yù)NF-κB p65核轉(zhuǎn)位，抑制巨噬細(xì)胞遷移，減少炎癥因子和ECM的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用，提示TAK1信號(hào)通路是參與DN腎臟損傷的重要機(jī)制之一，可能作為延緩DN進(jìn)展的新靶點(diǎn)。

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WeiJie,FengShirao,XuXingxin,etal

(Dept of Nephropathy, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230022)

Objective To investigate the effect of TGF-β activated kinase-1 inhibitor 5Z-7-oxozeaenol on the interaction between macrophages and mesangial cells on the condition of high glucose.Methods The macrophages and mesangial cells were cultured separately or co-cultured and divided into seven groups: inhibitor control group, mannitol control group, normal control group, high glucose group and high glucose+ inhibitor groups(high glucose+OZ 30,100,300 mmol/L).The expression of p-TAK1, TAK1 binding protein(TAB1), NF-κB p65 proteins of macrophages were analyzed by Western blot.The intracellular localization of NF-κB p65 was analyzed by cell immune fluorescence. The concentrations of TNF-α, IL-1β, MCP-1, Col Ⅳ and FN in each group cell media were determined by ELISA. Macrophages migration ability were observed microscope.Results Compared with control group, high glucose stimulate macrophage p-TAK1, TAB1, NF-κB p65 protein expression were significantly higher(P<0.05).Both in co-cultureand monolayer cell culture,high glucose increases the concentration of TNF-α,IL-1β, MCP-1, Col Ⅳ and FN(P<0.05). Exposed to high glucose, the concentration of TNF-α,IL-1β,MCP-1,Col Ⅳ and FN in co-cultured cells was higher than that in monolayer cells culture(P<0.05). 5Z-7-oxozeaenol could decrease those cytokines secretion with a concentration dependent manner, comparing with high glucose group(P<0.05). The number of macrophages migration were decreased by 300 nmol/L 5Z-7-oxozeaenol(P<0.05).Conclusion Exposed to high glucose,macrophages and mesangial cells can interact with each other to promote inflammation cytokines(TNF-α, IL-1β, MCP-1) and extracellular matrix components(Col Ⅳ, FN) secretion. TAK1 inhibitor can reduce inflammation cytokinesand the secretion of extracellular matrix components by intervening NF-κB p65 nuclear transfer and inhibiting macrophage migration.TAK1 inhibitor plays a key role in anti-inflammation, anti-fibrosis and renal protection.

TGF-β activated kinase-1;co-culture; diabetic nephropathy; inflammation; fibrosis

時(shí)間：2016-8-10 11:04:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.013.html

2016-07-07接收

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81270813)

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，合肥 230022

衛(wèi) 潔，女，碩士研究生；

吳永貴，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wuyonggui@medmail.com.cn

Col Ⅳ、FN均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，共培養(yǎng)細(xì)胞上清液中各種細(xì)胞因子含量較單培養(yǎng)升高更明顯(P<0.05)，與高糖組比較，TAK1抑制劑呈濃度依賴(lài)性降低各項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)(P<0.05)。300 nmol/L抑制劑明顯降低巨噬細(xì)胞遷移數(shù)目(P<0.05)。結(jié)論 高糖環(huán)境下，巨噬細(xì)胞與系膜細(xì)胞之間存在相互影響，這種作用能促進(jìn)炎癥因子(TNF-α、IL-1β、MCP-1)和細(xì)胞外基質(zhì)成分(Col Ⅳ、FN)產(chǎn)生增加，而TAK1抑制劑能通過(guò)干預(yù)NF-κB p65核轉(zhuǎn)位，抑制巨噬細(xì)胞遷移，減少炎癥因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分的分泌，發(fā)揮抗炎、抗纖維化效應(yīng)，從而起到腎臟保護(hù)作用。

R 587.24

A

1000-1492(2016)10-1453-07

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.013