滕會(huì)會(huì) 杜守穎 李鵬躍 陸洋 白潔 武慧超 孫如煜 張晴 杜秋

基于中藥指紋圖譜結(jié)合模式識(shí)別的清開(kāi)靈軟膠囊批次間穩(wěn)定性控制研究

滕會(huì)會(huì) 杜守穎 李鵬躍 陸洋 白潔 武慧超 孫如煜 張晴 杜秋

目的 基于中藥指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別方法尋找影響清開(kāi)靈軟膠囊批次間穩(wěn)定性的重點(diǎn)化學(xué)成分。方法 采用聚類(lèi)分析、主成分分析及偏最小二乘法模型對(duì)不同批次清開(kāi)靈軟膠囊的高效液相色譜法指紋圖譜進(jìn)行整體觀(guān)察和評(píng)價(jià),找出可能與相似度強(qiáng)相關(guān)的標(biāo)志物。結(jié)果

指紋圖譜; 化學(xué)模式識(shí)別; 清開(kāi)靈軟膠囊

清開(kāi)靈組方源于中醫(yī)治療急性熱病傳統(tǒng)處方“溫病三寶”中的安宮牛黃丸,具有清熱解毒、化痰通絡(luò)、醒神開(kāi)竅之功效,臨床療效顯著[1-2]。現(xiàn)行的清開(kāi)靈軟膠囊質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制還停留在幾個(gè)有效成分的定性和定量測(cè)定[3],由于中藥材或中藥制劑是通過(guò)內(nèi)部各種化學(xué)成分間協(xié)同作用發(fā)揮藥效作用的,僅以其中個(gè)別或幾個(gè)“有效成分”作為質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),很難準(zhǔn)確對(duì)中藥質(zhì)量進(jìn)行整體評(píng)價(jià)[4]。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的手段[5],但目前采用相似度評(píng)價(jià),不能立體、多維地對(duì)中藥材及其制劑的質(zhì)量進(jìn)行整體分析,而化學(xué)模式識(shí)別能實(shí)現(xiàn)中藥多維信息的綜合分析,已廣泛應(yīng)用于中藥材及中成藥的質(zhì)量控制研究[6-10]。因此,本研究采用高效液相色譜法(high performance liqwid chromatography,HPLC)建立清開(kāi)靈軟膠囊指紋圖譜,并用聚類(lèi)分析、主成分分析(principal component analysis,PCA)及偏最小二乘法(partial leasr square,PLS)等化學(xué)模式識(shí)別對(duì)所得圖譜進(jìn)行分析、解析,為全面控制清開(kāi)靈軟膠囊的批次間的穩(wěn)定性提供了方法。

1 儀器與試藥

日本島津高效液相色譜儀(LC-20AD泵,SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器,SPD-M20A檢測(cè)器);分析天平(賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);G20型醫(yī)用離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療機(jī)械有限公司);KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):110715-201318);甲醇、乙腈(Fisher公司,色譜純);磷酸(TED公司,色譜純);哇哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司);清開(kāi)靈軟膠囊(批號(hào): 14072411、15052042、15051641、15051941、15051841、15051942、15052041、15052241、15051741、15052111、15052141,每粒0.4 g,含黃芩苷20 mg)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 清開(kāi)靈軟膠囊指紋圖譜研究

2.1.1 色譜條件 Phenomenex Luna RP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相(A)0.4%磷酸的水溶液-(B)甲醇-乙腈(體積比為4∶1),梯度洗脫;流速1.0 mL/min;柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;進(jìn)樣量為5 μL。梯度洗脫程序:0～15分鐘,5%～30%B; 15～22分鐘,30%～35%B;22～40分鐘,35%～60% B;40～43分鐘,60%B;43～55分鐘,60%～81%B; 55～60分鐘,81%～90%B;60～65分鐘90%B。

2.1.2 溶液的配制 黃芩苷對(duì)照品溶液的配制:稱(chēng)量黃芩苷對(duì)照品適量,加70%甲醇超聲溶解,配制成含黃芩苷100 μg/mL的對(duì)照品溶液。軟膠囊供試品的制備:取1.2 g硅藻土置于蒸發(fā)皿中,精密稱(chēng)定,再取軟膠囊內(nèi)容物0.4 g,精密稱(chēng)定于上述蒸發(fā)皿中,研勻后,將其全部轉(zhuǎn)入錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,密塞,稱(chēng)定重量,超聲70分鐘(功率200 W,頻率40 KHz),再稱(chēng)定重量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,吸取5 mL以10000 rpm離心10分鐘,上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液,即得。

2.1.3 指紋圖譜分析方法及數(shù)據(jù)處理方法 中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)進(jìn)行指紋圖譜分析,多元數(shù)據(jù)分析和建模由SIMCA-P 11.5軟件及SPSS 16.0來(lái)完成。

2.1.4 清開(kāi)靈軟膠囊指紋圖譜方法學(xué)考察 (1)精密度考察:取同一批號(hào)供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜1.3%,相對(duì)峰面積的RSD均＜2.8%,表明儀器精密度良好,符合指紋圖譜要求。(2)穩(wěn)定性考察:取同一供試品溶液,分別于0、2、4、6、12、24小時(shí)進(jìn)樣檢測(cè),結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜0.12%,相對(duì)峰面積的RSD均＜3%,其相似度均大于99%,表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好,符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求。(3)重現(xiàn)性考察:取同一批號(hào)供試品6份,按2.1.2項(xiàng)下對(duì)應(yīng)的方法制備各供試品,分別進(jìn)樣檢測(cè),結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜0.12%,相對(duì)峰面積的RSD均＜2.7%,其相似度均大于99%,表明方法具有較好的重復(fù)性,符合指紋圖譜的要求。(4)樣品測(cè)定:取11批清開(kāi)靈軟膠囊,分別按2.1.2項(xiàng)下制備各供試液并按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè),并用中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件進(jìn)行分析,以黃芩苷色譜峰作為參照峰,其保留時(shí)間為38.395分鐘,標(biāo)示出了清開(kāi)靈軟膠囊

21個(gè)共有峰(如圖1),共有峰面積所占總面積比例為87.42%,相似度均為1。(5)相似度評(píng)價(jià):由于清開(kāi)靈軟膠囊經(jīng)HPLC檢測(cè)所得色譜圖中,黃芩苷色譜峰面積過(guò)大,峰高與其他峰高差異太大,因此考慮將其剔除后再計(jì)算相似度,保證相似度的準(zhǔn)確性。結(jié)果所得11批次清開(kāi)靈軟膠囊的相似度為0.994、0.993、0.995、0.992、0.92、0.998、0.992、0.994、0.989、0.992、0.976。

圖1 11批清開(kāi)靈軟膠囊指紋圖譜

2.2 基于化學(xué)模式識(shí)別方法對(duì)不同批次清開(kāi)靈軟膠囊進(jìn)行整體性評(píng)價(jià)

前期實(shí)驗(yàn)得到清開(kāi)靈軟各自批次間的相似度均較高,但剔除黃芩苷與不剔除黃芩苷后所得兩者的相似度差異明顯,為了所得相似度的準(zhǔn)確性,在接下來(lái)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行模式識(shí)別分析,結(jié)合清開(kāi)靈軟膠囊11個(gè)樣本批次的整體聚集,分散情況得到更符合實(shí)際情況的相似度,并通過(guò)PLS模型分析相似度與變量之間的關(guān)系找到與相似度有密切聯(lián)系的化學(xué)成分。

2.2.1 系統(tǒng)聚類(lèi)分析 將清開(kāi)靈軟膠囊指紋圖譜數(shù)據(jù)經(jīng)歸一化處理后進(jìn)行聚類(lèi)分析,采用Ward法(Ward’s Method),利用平方Euclidean距離(Squared Euclidean distance)作為樣品的測(cè)度進(jìn)行分析。結(jié)果見(jiàn)圖2,聚類(lèi)分析將11批樣品分為4類(lèi)。樣本中S1、S7、S10、S6、S9為第Ⅰ類(lèi),S3、S8、S2、S4為第Ⅱ類(lèi),S11為第Ⅲ類(lèi),S5在第IV類(lèi),這四大類(lèi)又繼續(xù)分成更小的類(lèi)別,其中Ⅰ類(lèi)分為A類(lèi)和B類(lèi),說(shuō)明在同一類(lèi)別里S9與S1、S7、S10、S6相差較遠(yuǎn),Ⅱ類(lèi)分為C類(lèi)和D類(lèi),說(shuō)明S4與S3、S8、S2在同一類(lèi)別里相差較遠(yuǎn),結(jié)果表明,在劑型一致的前提下,不同批號(hào)的清開(kāi)靈制劑樣品存在差異。由剔除黃芩苷后相似度結(jié)果,S5相似度為0.92,S11為0.976,在11批樣品中相似度最低,S1、S7、S10、S6、S9相似度分別0.994、0.992、0.992、0.998、0.989,S9相似度最低,S3、S8、S2、S4的相似度為0.995、0.994、0.993、0.992,S4的相似度最低,這與聚類(lèi)分析分類(lèi)結(jié)果一致。

圖2 聚類(lèi)分析

2.2.2 PCA分析 通過(guò)將清開(kāi)靈軟膠囊指紋圖譜數(shù)據(jù)經(jīng)歸一化處理后導(dǎo)入SIMCA-P中,得4個(gè)主成分PCA模型,如圖3所示,模型的R2X為89.8%, Q2Y為67.9%,解釋度很高,符合實(shí)驗(yàn)要求。分別繪制出得分圖及其3D圖(圖4)、PCA得分與載荷匯總圖(圖5)。

圖3 PCA主成分參數(shù)

由圖4可看出,樣品點(diǎn)在四個(gè)象限存在離散的情況,即不同批次樣品在處理后經(jīng)HPLC測(cè)定的結(jié)果之間還是存在一定的差異,進(jìn)一步分析樣本分布情況,S1、S6、S7、S10在右下第四象限高度聚集在一起,S2、S3、S4、S8在第三象限分布較近,S5、S9、S11分布在中上部分,距離較遠(yuǎn)。這與剔除黃芩苷后所得相似度大小規(guī)律相一致,所得結(jié)果與聚類(lèi)分析一致,說(shuō)明黃芩苷由于峰過(guò)高過(guò)大,會(huì)對(duì)相似度計(jì)算的準(zhǔn)確性有一定的影響,將其剔除后相似度結(jié)果比較符合實(shí)際情況。

圖4 PCA得分圖(上)及其3D圖(下)

由圖5可見(jiàn),樣本可分為右下,左下及中上三部分。中上部分的S5、S9、S11相似度為0.92、0.989、0.976,而右下及左下部分的S1、S2、S3、S4、S6、S7、S8、S10相似度均大于0.99,且樣本S1、S6、S7、S10在右下部分高度聚集在一起,即樣品的相似度從右下至左上存在遞減的趨勢(shì)。而通過(guò)載荷分析,每個(gè)象限的變量分布不一樣,為了尋找對(duì)批次間相似度影響較大的化合物,擬以相似度作為Y變量,進(jìn)行PLS分析。

2.2.3 基于PLS的重點(diǎn)化學(xué)成分篩選 通過(guò)將清開(kāi)靈軟膠囊指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P中,峰面積為X矩陣,相似度為Y變量,進(jìn)行PLS分析。得3個(gè)主成分,如圖6所示。PLS模型的R2X為0.826, R2Y為0.997,Q2為0.953,能夠解釋82.6%的X變量,解釋99.7%的Y變量,交叉有效性為95.3%;解釋指標(biāo)及預(yù)測(cè)指標(biāo)均較高,模型擬合較好。分別繪制出預(yù)測(cè)值與觀(guān)測(cè)值擬合曲線(xiàn)圖(圖7)、載荷圖(圖8)、各化合物系數(shù)圖(圖9)、和各化合物VIP值圖(圖10),考察與相似度(Y)聯(lián)系密切的樣品或化學(xué)成分。

圖5 PCA得分與載荷匯總圖

圖6 PLS模型主成分參數(shù)

由圖7可見(jiàn)PLS模型的預(yù)測(cè)值與觀(guān)測(cè)值基本一致,R2=0.9969,RMSEE=0.0015,模型擬合較好,能夠很好的通過(guò)模型預(yù)測(cè)Y。

圖7 PLS模型中預(yù)測(cè)值與觀(guān)測(cè)值擬合曲線(xiàn)

圖8可得,峰號(hào)77、5、82、19、3、74、56、51、79、88、34、63、39共13個(gè)化學(xué)成分與Y分布最近,呈正相關(guān);峰號(hào)99、4、29、50、15、17、18、35與Y距離最遠(yuǎn),呈負(fù)相關(guān)。由圖9、10可得,13個(gè)化學(xué)成分的系數(shù)及VIP值均大于1,較其他成分高,說(shuō)明這13個(gè)峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分對(duì)軟膠囊相似度貢獻(xiàn)較大。通過(guò)將這13個(gè)成分的第一主成分loading值、系數(shù)分布及vip值(閾值＞1)相關(guān)參數(shù)總值|r|對(duì)比,再結(jié)合色譜峰比對(duì)、與相似度進(jìn)行相關(guān)性分析(SPSS 16.0, Pearson Correlation Coefficients),篩選出3個(gè)化合物,結(jié)果見(jiàn)表1。由表可知,峰號(hào)82、19、77總值|r|均大于1.6,色譜峰比對(duì)得到相應(yīng)保留時(shí)間,相關(guān)性分析參數(shù)R值均大于0.8,P值均小于0.05,說(shuō)明該3個(gè)化合物與相似度存在較強(qiáng)的相關(guān)性,最終確定峰號(hào)82、19、77共3個(gè)化學(xué)成分為與相似度密切相關(guān)的潛在標(biāo)志物,其中82號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分為黃芩苷。

圖8 PLS載荷圖

圖9 PLS中各化學(xué)成分的系數(shù)結(jié)果

圖10 PLS中各化合物的VIP值

表1 軟膠囊相似度潛在標(biāo)志物相關(guān)參數(shù)表

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了系統(tǒng)聚類(lèi)分析和主成分分析法兩種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分別對(duì)清開(kāi)靈軟膠囊指紋圖譜色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了模式識(shí)別的初探,經(jīng)過(guò)分析與比較得到如下結(jié)論:兩種分析方法均將樣品分為四類(lèi),從整體分類(lèi)效果上來(lái)看,主成分投影法更為直觀(guān),能一目了然地看出各個(gè)分類(lèi)樣本之間的聚類(lèi)關(guān)系,聚類(lèi)分析法則能體現(xiàn)出分類(lèi)樣本間內(nèi)在的相互聯(lián)系,兩種分析結(jié)果基本一致,可見(jiàn),聚類(lèi)分析與主成分分析方法可以互相佐證,為可信的數(shù)據(jù)分析方法。

目前指紋圖譜的評(píng)價(jià)以相似度作為門(mén)檻,而多數(shù)學(xué)者認(rèn)為指紋圖譜中峰面積大及峰高較高的峰會(huì)對(duì)相似度的準(zhǔn)確性有一定的影響,但該方面的研究報(bào)道卻很少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)系統(tǒng)聚類(lèi)分析和主成分分析兩種方法分析樣本的聚集、分布情況,得到清開(kāi)靈軟膠囊11個(gè)批次樣本分布存在離散情況,說(shuō)明各個(gè)批次之間存在一定的差異,其相似度不可能均在1左右;進(jìn)一步分析樣本聚集情況,發(fā)現(xiàn)其與剔除黃芩苷后相似度的大小規(guī)律相接近,因此得出剔除黃芩苷后所得相似度更符合實(shí)際情況。

實(shí)驗(yàn)中,由PCA分析得到樣品的相似度從右下至左上存在遞減的趨勢(shì)。通過(guò)載荷分析,發(fā)現(xiàn)每個(gè)象限的變量并不是均勻分布,說(shuō)明變量與相似度之間也可能存在某種聯(lián)系,因此進(jìn)一步通過(guò)PLS模型分析,建立相似度與變量之間的關(guān)系,找出與相似度密切相關(guān)的標(biāo)志物,最終得到3個(gè)標(biāo)志物。其中一個(gè)標(biāo)志物為黃芩苷,已列入藥典質(zhì)量限定范圍,提示有必要將其它未列入質(zhì)量限定范圍標(biāo)志物列入質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)成功地對(duì)清開(kāi)靈軟膠囊HPLC指紋圖譜進(jìn)行了初步研究,該分析及數(shù)據(jù)處理方法能實(shí)現(xiàn)清開(kāi)靈軟膠囊指紋圖譜的整體分析,不僅建立了清開(kāi)靈軟膠囊指紋圖譜,驗(yàn)證了峰面積大及峰高較高的峰確實(shí)會(huì)對(duì)相似度的準(zhǔn)確性有一定的影響,同時(shí)找出了與相似度強(qiáng)相關(guān)的標(biāo)志物,說(shuō)明該方法能運(yùn)用于中藥及中藥材的批次間穩(wěn)定性的控制研究。由于時(shí)間原因,未對(duì)其他標(biāo)志物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,筆者團(tuán)隊(duì)后續(xù)將會(huì)進(jìn)行深入研究。

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Based on fingerprint combined with chemical pattern recognition for stability control study between different batches of Qingkailing soft capsules

TENG Hui-hui,DU Shou-ying,LI Peng-yue,et al. School of Chinese Pharmacy,Beijing University of TCM,Beijing 100102,China

DU Shou-ying,E-mail:dushouying@263.net

Objective Based on fingerprint combined with chemical pattern recognition method for Qingkailing soft capsule on the stability of key chemical composition between different batches.Methods Cluster analysis,PCA and PLS model were used for observation and evaluation of different batches of soft capsules on the HPLC fingerprint,markers associated with similarity were identified.Results The system clustering analysis and principal component analysis showed that after eliminating chromatographic peak of baicalin similarity calculation the results was more in line with the actual situation.The PLS analysis was got 3 chemical component that was closely related to the similarity.The three compounds can be used as a

Fingerprint; Chemical pattern recognition; Qingkailing soft capsules

R284

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.11.010

2015-06-23)

(本文編輯:董歷華)

北京市科技新星計(jì)劃(xx2015A048)

100102 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院[滕會(huì)會(huì)(碩士研究生)、杜守穎、李鵬躍、白潔、陸洋、武慧超、孫如煜(碩士研究生)、張晴(碩士研究生)、杜秋(碩士研究生)]

滕會(huì)會(huì)(1988-),女,2013級(jí)在讀碩士研究生。研究方向:中藥中藥新劑型與新技術(shù)研究。E-mail:h15810377850@163.com

杜守穎(1960-),女,博士,教授,博士生導(dǎo)師。研究方向:中藥新劑型與制劑關(guān)鍵技術(shù)。E-mail: dushouying@263.net

通過(guò)系統(tǒng)聚類(lèi)分析及主成分分析表明剔除黃芩苷色譜峰后的相似度計(jì)算結(jié)果更符合實(shí)際情況;經(jīng)偏最小二乘法分析得到3個(gè)化學(xué)成分與相似度密切相關(guān),該3個(gè)化合物可作為控制清開(kāi)靈軟膠囊批次間穩(wěn)定性的重點(diǎn)化學(xué)成分。結(jié)論 該中藥指紋圖譜-化學(xué)模式識(shí)別方法用于中藥不同批次間穩(wěn)定性控制研究是可行的。

key of chemical composition which influenced the stability of soft capsule between different batches. Conclusion The TCM fingerprint and chemical pattern recognition method is feasible for traditional Chinese medicine(TCM)between different batches stability control research.