徐麗娟 許斐 臧春柳 趙層閃 劉學(xué)飛 楊麗靜 田軍彪

·濁毒研究專題·

復(fù)方菖蒲益智湯對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性的影響

徐麗娟 許斐 臧春柳 趙層閃 劉學(xué)飛 楊麗靜 田軍彪

目的 觀察復(fù)方菖蒲益智湯對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷早期腦組織中Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性的影響。方法 實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、復(fù)方菖蒲益智湯高、低劑量組、尼莫地平對(duì)照組。采用夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈的方法制備腦缺血再灌注損傷模型小鼠,給藥14天后進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分,并采用HE染色,光鏡下觀察海馬區(qū)腦組織的病理形態(tài)學(xué)變化,測(cè)定腦組織Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性。結(jié)果 各用藥組小鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞損傷程度、神經(jīng)功能缺損程度比模型組均有所減輕,以復(fù)方菖蒲益智湯高劑量組效果最為明顯,高劑量組小鼠的Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性高于模型組、低劑量組及尼莫地平組(P＜0.01)。結(jié)論 復(fù)方菖蒲益智湯能夠提高腦缺血再灌注小鼠腦組織Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性,對(duì)于小鼠腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。

腦缺血再灌注損傷; 復(fù)方菖蒲益智湯; Ca2+-ATP酶; Na+-K+-ATP酶

缺血性腦血管病是臨床致殘率極高的常見病、多發(fā)病,腦缺血可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷,而恢復(fù)血流灌注后,腦組織損傷反而進(jìn)一步加重,甚至出現(xiàn)不可逆性腦損傷,通常稱為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI),而腦缺血再灌注損傷早期是搶救缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞的關(guān)鍵時(shí)期[1]。復(fù)方菖蒲益智湯是田軍彪教授治療缺血性腦血管病的經(jīng)驗(yàn)方,具有化濁解毒、活血通絡(luò)的功效,是在中醫(yī)“濁毒”和“瘀血”理論指導(dǎo)下,針對(duì)中風(fēng)主要病機(jī)“痰濁閉阻清竅,瘀毒損傷腦絡(luò)”而精選的有效方劑[2]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察復(fù)方菖蒲益智湯對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷早期腦組織中Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性的影響,結(jié)合小鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變以及小鼠神經(jīng)功能損傷程度來探討本方在CIRI保護(hù)中的作用機(jī)理,為臨床治療提供客觀理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及分組

SPF級(jí)健康昆明小鼠50只,均為雄性,體質(zhì)量(25±3)g,河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):1202160。按照隨機(jī)數(shù)字表法,將小鼠分為5組:假手術(shù)組、模型組、中藥高劑量組(簡(jiǎn)稱高劑量組)、中藥低劑量組(簡(jiǎn)稱低劑量組)、尼莫地平對(duì)照組(簡(jiǎn)稱尼莫地平組),每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及儀器

對(duì)照藥物:尼莫地平,規(guī)格為20 mg/片,天津市中央藥業(yè)有限公司生產(chǎn),國(guó)藥準(zhǔn)字H10910040。以蒸餾水溶解,配制成濃度為0.78 mg/mL的混懸液。

復(fù)方菖蒲益智湯(采用河北省中醫(yī)院中藥房所供飲片):石菖蒲15 g、益智仁15 g、當(dāng)歸9 g、丹參15 g、川芎9 g、地龍15 g、赤芍15 g、茯苓15 g、郁金15 g、黃連6 g、澤瀉6 g。上述飲片由制劑室水煎濃縮后4℃保存。

主要試劑及儀器:蘇木素-伊紅染液,Na+-K+-ATP酶含量測(cè)定試劑盒,Ca2+-ATP酶含量測(cè)定試劑盒,以上試劑均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。水合氯醛、酒精、生理鹽水、高速冷凍離心機(jī)(上海安亭),半自動(dòng)生化分析儀(Humalyzer)等均由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3 模型制備

小鼠飼養(yǎng)于室溫24℃～26℃的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(河北醫(yī)科大學(xué)西校區(qū)),術(shù)前禁食12小時(shí),自由飲水。在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室內(nèi)行手術(shù)造模,采用微型動(dòng)脈夾間斷夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈法造成小鼠腦組織缺血再灌注損傷[3]。將小鼠用10%水合氯醛以0.3 mL/100 g的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉,取頸前正中縱行切口,長(zhǎng)約1～1.5 cm,暴露頸總動(dòng)脈,鈍性剝離雙側(cè)的頸總動(dòng)脈,以微型動(dòng)脈夾阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流,10分鐘后松開動(dòng)脈夾,恢復(fù)頸總動(dòng)脈血液灌注10分鐘,反復(fù)進(jìn)行三次,再灌注24小時(shí)。其中假手術(shù)組分離頸總動(dòng)脈后不進(jìn)行動(dòng)脈夾夾閉,余步驟與其余四組相同。術(shù)后給予保溫、預(yù)防感染等措施,保證小鼠正常進(jìn)食、飲水。

1.4 給藥方法

造模成功后第2天開始給藥,高劑量組按照17.55 g/(kg·d)的劑量灌服復(fù)方菖蒲益智湯中藥液,低劑量組按照8.78 g/(kg·d)的劑量灌服中藥液,尼莫地平組按照0.03 g/(kg·d)的劑量灌服尼莫地平液,假手術(shù)組、模型組按照20 mL/(kg·d)的劑量灌服生理鹽水,每天1次,連續(xù)用藥14天。

1.5 檢測(cè)方法

術(shù)后24小時(shí)小鼠完全清醒后,以“5分法”進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分[4]。無(wú)神經(jīng)缺損癥狀為0分;輕度局灶性神經(jīng)功能缺損(不能完全伸展一側(cè)前肢)為1分;中度局灶性神經(jīng)功能缺損(爬行時(shí)向一側(cè)轉(zhuǎn)圈)為2分;重度局灶性神經(jīng)功能缺損(行走時(shí)向一側(cè)傾倒)為3分;意識(shí)水平降低,不能自主行走為4分;死亡為5分。1～3分為有效模型。剔除死亡、無(wú)效模型,并遵循隨機(jī)原則補(bǔ)充動(dòng)物。

各組小鼠分別于給藥14天后予10%水合氯醛以0.40 mL/100 g劑量腹腔注射麻醉,斷頭處死,立即在冰盤上取出腦組織,甲醛固定、脫水包埋、切片染色(蘇木精-伊紅hematoxylin-eosin staining,HE),在400倍光鏡下觀察各組小鼠海馬CAI區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

取右側(cè)腦皮質(zhì)組織與4℃的生理鹽水混合,制成1%勻漿,經(jīng)高速離心機(jī)以3000 rpm離心處理后

取上清液進(jìn)行Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,統(tǒng)計(jì)方法采用Dunnett’T3檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分

手術(shù)后24小時(shí),與假手術(shù)組相比,其余四組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分顯著增高(P＜0.05),但小鼠神經(jīng)功能評(píng)分無(wú)明顯差異,造模成功。連續(xù)用藥14天后,模型組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯高于各給藥組(P＜0.05);中藥低劑量組及尼莫地平組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分均高于中藥高劑量組(P＜0.05);尼莫地平組與中藥低劑量組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分無(wú)明顯差異。見表1。 __

表1 各組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分(±s,n=10)___

表1 各組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分(±s,n=10)___

注:與模型組比較,aP＜0.05;與中藥高劑量組比較,bP＜0.05。

_______組別________________________________________________術(shù)后24小時(shí)用藥14天假手術(shù)組--模型組2.61±0.222.41±0.22中藥高劑量組2.52±0.171.51±0.17a中藥低劑量組2.30±0.212.23±0.28ab____尼莫地平組______2.55±0.1_____________________ 7 2.46±0.21ab__________

2.2 各組小鼠腦組織海馬CAI區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)

光鏡下觀察HE染色切片可見:假手術(shù)組小鼠海馬錐體細(xì)胞形態(tài)正常,核仁清晰,細(xì)胞質(zhì)豐富,細(xì)胞排列整齊致密,層次清晰,未見膠質(zhì)細(xì)胞增生,見圖1A。模型組小鼠海馬形態(tài)正常的錐體細(xì)胞明顯減少,且錐體細(xì)胞的細(xì)胞核固縮深染,層次稀疏,排列紊亂,有明顯的細(xì)胞脫失,大量膠質(zhì)細(xì)胞增生,神經(jīng)纖維雜見,見圖1B。高劑量組海馬形態(tài)正常的錐體細(xì)胞數(shù)量占絕大部分,偶見細(xì)胞核固縮深染及細(xì)胞脫失,細(xì)胞的排列較為整齊,但層次較假手術(shù)組有所減少,見圖1C。低劑量組、尼莫地平組海馬正常形態(tài)的錐體細(xì)胞數(shù)量減少,較多細(xì)胞可見核固縮及深染,細(xì)胞層次疏松,間隙增大,可見少量細(xì)胞脫失,見圖1D、1E。

2.3 各組小鼠腦組織Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶含量

與假手術(shù)組相比,其余四組小鼠腦組織中Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶含量明顯降低(P＜0.05)。與模型組相比,各用藥組小鼠腦組織中Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶含量明顯升高(P＜0.05)。與低劑量組及尼莫地平組相比,高劑量組的Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶含量升高(P＜0.05)。見表2。

圖1 CIRI小鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞病理形態(tài)(HE×400)

表2 各組小鼠腦組織Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶含量(±s,n=10)

表2 各組小鼠腦組織Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶含量(±s,n=10)

注:與假手術(shù)組比較,aP＜0.05;與模型組比較:bP＜0.05;與中藥高劑量組比較:cP＜0.05;與尼莫地平組比較:dP＞0.05。

組別Na+-k+-AT酶(U/mgprot)____________ Ca2+-ATP酶(U/mgprot)________ 6.08±0.113.85±0.07模型組2.80±0.16a1.85±0.04a尼莫地平組3.95±0.06bc2.67±0.06bc中藥高劑量組5.06±0.06ab3.26±0.04ab中藥低劑量組_____3.97±0.05bcd_______________2.71±0.05假手術(shù)組bcd_________

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為臨床治療缺血性卒中時(shí)不僅要及時(shí)恢復(fù)大腦血液供應(yīng),還應(yīng)盡量減輕CIRI。針對(duì)CIRI發(fā)生機(jī)制的研究涉及細(xì)胞能量代謝障礙、鈣超載、免疫炎癥反應(yīng)、凋亡基因啟動(dòng)、氧自由基大量釋放、興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用等多個(gè)方面,多因素綜合作用下造成瀑布式級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致腦細(xì)胞水腫、壞死、凋亡[5]。因?yàn)槟X組織對(duì)缺血、缺氧的極度敏感,在腦缺血早期即可出現(xiàn)腦細(xì)胞氧化磷

酸化功能降低,ATP合成障礙,導(dǎo)致Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性的降低,從而引起細(xì)胞內(nèi)Na+、Cl-潴留,而K+大量外流,同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)失常,導(dǎo)致胞漿內(nèi)大量Ca2+沉積于線粒體,激活了細(xì)胞內(nèi)多種降解酶釋放,引發(fā)細(xì)胞水腫、溶解、死亡等一系列損害,發(fā)生細(xì)胞毒性腦水腫。國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為,腦缺血再灌注后諸多因素共同導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞器內(nèi)Ca2+超載是腦組織細(xì)胞死亡的“共同通路”。

中醫(yī)雖然沒有關(guān)于CIRI的文字記載,但CIRI是中風(fēng)病發(fā)病過程中出現(xiàn)的一個(gè)病理過程,應(yīng)歸屬于“中風(fēng)”范疇;傳統(tǒng)認(rèn)為中風(fēng)之病機(jī)多由痰濁、瘀血蒙蔽清竅、阻滯脈絡(luò)而產(chǎn)生神識(shí)不清、肢體不遂、舌強(qiáng)語(yǔ)蹇等癥狀。筆者在中醫(yī)“濁毒”理論指導(dǎo)下,結(jié)合“瘀血”學(xué)說,發(fā)現(xiàn)對(duì)中風(fēng)病機(jī)的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)中,僅強(qiáng)調(diào)了“痰濁”“瘀血”,對(duì)“毒邪”致病認(rèn)識(shí)不足,治療中不夠重視。結(jié)合臨床實(shí)踐認(rèn)為,中風(fēng)多發(fā)于老年人,其臟腑虛衰,脾失健運(yùn)則痰濁內(nèi)生,阻滯氣機(jī),氣滯則血瘀,《血證論》云“血在上則濁蔽而不明矣”,瘀濁之為病,蘊(yùn)積日久而成毒,“濁”“瘀”“毒”互為因果,損傷臟腑經(jīng)脈而百病叢生。對(duì)中風(fēng)病而言,其主要病機(jī)為“痰濁閉阻清竅,瘀毒損傷腦絡(luò)”。結(jié)合現(xiàn)代病理研究,急性腦缺血中的“濁毒”是因缺血、缺氧、能量代謝障礙引起的一系列病理過程中產(chǎn)生的大量有害物質(zhì),既是病因也是病理產(chǎn)物。臨床上制定了化濁解毒、活血通絡(luò)的治療大法,篩選出了復(fù)方菖蒲益智湯,治療中風(fēng)、認(rèn)知障礙等療效肯定。方中以石菖蒲開竅豁痰、化濁醒神,丹參、當(dāng)歸、赤芍活血化瘀,川芎為血中氣藥,配合郁金行氣活血,蟲類藥地龍可清熱息風(fēng)、通行經(jīng)絡(luò),茯苓、澤瀉滲濕利水以化濁,黃連清熱燥濕以解毒,益智仁溫腎固精,補(bǔ)益腦髓?，F(xiàn)代藥理研究表明,石菖蒲的有效成份可以影響CaMKⅡ信號(hào)通路,調(diào)控凋亡基因表達(dá),減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡[6];當(dāng)歸多糖可抑制Cleaved caspase-3及bax的表達(dá),同時(shí)增強(qiáng)bcl-2表達(dá),從而減少腦缺血再灌注損傷大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[7];丹參酮ⅡA可提高局灶性腦缺血急性期大鼠細(xì)胞核p-CREB和細(xì)胞TORC1的蛋白表達(dá)水平,減少腦梗死體積,在大鼠腦缺血急性期應(yīng)用有腦保護(hù)作用[8];此外復(fù)方菖蒲益智湯中采用的中藥川芎、赤芍、地龍等均有確切的改善腦組織代謝的作用,可見中醫(yī)傳統(tǒng)理論指導(dǎo)下組方與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)經(jīng)驗(yàn)亦相契合。

本實(shí)驗(yàn)觀察了Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶在腦缺血再灌注損傷早期的含量變化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,復(fù)方菖蒲益智湯能夠提高腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性,且高劑量中藥組療效更佳,該組小鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞的受損程度、神經(jīng)功能損傷亦較輕,其機(jī)理可能與復(fù)方菖蒲益智湯改善了腦組織能量代謝水平以及抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān),這為復(fù)方菖蒲益智湯臨床應(yīng)用提供了一定的客觀理論依據(jù),但該方藥亦存在調(diào)節(jié)炎癥因子釋放、抑制炎癥反應(yīng)等作用機(jī)制[9],仍有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

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Protective effect of Changpu Yizhi compound decoction on cerebral ischemia and reperfusion injury in mice

XU Li-juan,XU Fei,ZANG Chun-liu,et al.Traditional Chinese Medicine Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050011,China

TIAN Jun-biao,E-mail:jbt1965@sina.com

Objective To observe the effect of Changpu Yizhi compound decoction on the activity of Ca2+-ATPase and Na+-K+-ATPase in brain tissue of mice in the early stage of cerebral ischemia and reperfusion injury.Methods Mice were randomly divided into sham operation group,model group,high and low doses of Changpu Yizhi compound decoction group and nimodipine control group.Cerebral ischemia and reperfusion injury(CIRI)mice model was prepared through blocking both side carotid arteries.After continuous medication for 14 days,neurological injury score was evaluated,and pyramidal cell morphology of the hippocampal region was observed under light microscope after HE staining.The activity of the Ca2+-ATPase and Na+-K+-ATPase in the brain tissue was detected.Results Compared with the model group,the injury of hippocampal pyramidal cells of each medical group was alleviated and neurological function deficit was lowered,especially in the high dose group.The activity of the Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase in the high dose group was higher than that of the other groups except the sham operation group(P＜0.01).Conclusion Changpu Yizhi compound decoction could enhance the activity of

Cerebral ischemia and reperfusion injury; Changpu Yizhi compound decoction; Ca2+-ATPase; Na+-K+-ATPase

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.11.001

2016-05-13)

(本文編輯:禹佳)

河北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(H2013206393);河北省科技支撐計(jì)劃(15277748D);河北省省級(jí)中醫(yī)藥類重大醫(yī)學(xué)科研課題(zyzd2013004);河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃(2014039);河北省政府資助臨床醫(yī)學(xué)優(yōu)秀人才培養(yǎng)和基礎(chǔ)課題(361025)

050011 石家莊,河北省中醫(yī)院脾胃病科(徐麗娟、劉學(xué)飛、楊麗靜、田軍彪、);河北省晉州市人民醫(yī)院脾胃病科(許斐);河北省唐縣中醫(yī)院脾胃病科(臧春柳);河北省衡水市中醫(yī)院脾胃病科(趙層閃)

徐麗娟(1978-),女,碩士,主治醫(yī)師。研究方向:神經(jīng)及腦血管疾病診治。E-mail:xlj_alice@ 126.com

田軍彪(1964-),博士,教授。研究方向:腦血管疾病中醫(yī)藥防治研究。E-mail:jbt1965@sina.com

the Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase in mice with cerebral ischemia and reperfusion injury,indicated its protective effect on the injury.