梅鑫 張清平 陳建良 陳銀生 張潔 陳芙蓉 陳忠平* (中山大學腫瘤防治中心神經外科，廣東 廣州 50060; 深圳市福田區(qū)人民醫(yī)院神經外科，廣東 深圳 580; 蘇州大學第一附屬醫(yī)院神經外科，江蘇 蘇州 5000)

四通道熒光成像觀察膠質母細胞瘤的血管起源

梅鑫1張清平2陳建良2陳銀生1張潔3陳芙蓉1陳忠平1*
(1中山大學腫瘤防治中心神經外科，廣東 廣州 510060;2深圳市福田區(qū)人民醫(yī)院神經外科，廣東 深圳 518033;3蘇州大學第一附屬醫(yī)院神經外科，江蘇 蘇州 215000)

目的膠質瘤的血管起源于宿主還是腫瘤本身一直存在爭議。我們先前的研究發(fā)現膠質瘤干細胞有向內皮細胞分化的能力。方法本研究我們將膠質瘤干細胞用熒光蛋白標記后，移植于熒光鼠皮下成瘤，再采用熒光標記腫瘤血管內皮細胞(CD34)，通過四通道熒光顯像觀察移植瘤的血管。結果我們在膠質瘤干細胞GSC-1建立穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白的RFP-GSC-1細胞系。在綠色熒光裸鼠移植成瘤后，對移植瘤標本的四通道熒光成像結果顯示：移植瘤的大部分血管來源于宿主，但在其中一個移植瘤中發(fā)現有移植腫瘤細胞來源的血管內皮細胞，位于腫瘤中央區(qū)域。結論本研究結果提示，移植瘤的血管主要是宿主來源細胞為主的管道，同時也存在腫瘤細胞來源的管道。

膠質母細胞瘤; 熒光裸鼠; 免疫熒光

近年研究發(fā)現膠質瘤血管新生方式不僅僅有傳統(tǒng)觀念認為的宿主血管來源的芽生和套疊[1]。膠質母細胞瘤中存在一種新的血管生成模式，即擬態(tài)管道發(fā)生[2]。對于這種不表達或者低表達內皮細胞標記物的管道上構成管壁細胞的來源研究很少。有學者認為是具有多項分化能力的腫瘤干細胞向內皮細胞分化形成[3]，也有學者認為是腫瘤轉移過程中滯留在血管壁上的一個短暫的現象[4]。也有認為其來源于宿主骨髓造血干細胞[5]，骨髓間充質干細胞[6]。為了能夠闡明擬態(tài)管道上的管壁細胞的來源，我們需要建立一個觀察模型來顯現管道形成的過程。

研究發(fā)現特定條件下進行三維培養(yǎng)的膠質瘤細胞(RFP-GSC-1)能逐漸形成管道樣結構，同時細胞表面的分子標記物也在變化，逐漸表達內皮細胞標記物[7]。體外的膠質瘤細胞是在特定條件下向內皮細胞分化，對于體內環(huán)境中的膠質瘤細胞如何在腫瘤形成早期獲得血供我們還不是很清楚。我們將體外研究使用的RFP-GSC-1細胞進一步用于裸鼠移植瘤模型，來探尋體內膠質瘤微循環(huán)模式的構筑。

裸鼠移植瘤模型能很好的模擬腫瘤發(fā)生時的體內環(huán)境，準確反映宿主和腫瘤之間的相互影響下管道形成的模式。由于需要同時觀察腫瘤細胞、裸鼠自身內皮細胞和腫瘤細胞表面分子標記物，我們建立了四通道熒光成像觀察熒光鼠移植瘤模型，觀察腫瘤血管新生模式，從而分析擬態(tài)管道管壁細胞的來源。

材料與方法

一、主要試劑和設備

表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)(Sigma, 美國)、成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)(Sigma, 美國)、B27(Invitrogen, 美國)、DMEM/F12(Gbico, 美國)、Triton-X100 (中衫金橋, 中國)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)(中衫金橋, 中國)、Alexa fluor@647(Abcam, 美國)、抗淬滅劑(Abcam, 美國)、一抗均來自美國Abcam公司。5只4 w齡Foxn1nu/b6-cag-egfp/su品系鼠，為蘇州大學附屬第二醫(yī)院黃強等[8]建立的出生后全身組織細胞帶有綠色熒光的無胸腺免疫裸鼠(許可證號碼：SYXK(蘇)2012-0045)由蘇州大學實驗動物中心提供。按spf(specific pathogen free animals)標準飼養(yǎng)。流式細胞儀(Beckman-Coulter, 美國)、慢病毒(GeneChem, 中國)。

二、建立RFP-GSC-1細胞系

復蘇之前本實驗室建立的GSC-1細胞系[7]并控制其處于對數生長期，向細胞懸液中加入5 μl Polybrene以及2 ml的病毒培養(yǎng)上清，混勻，懸浮培養(yǎng)于添加0.04 ng/ml EGF、1 μl/ml bFGF、0.02 ml/ml B27的DMEM/F12干細胞培養(yǎng)液中。感染6 h后加入2 ml新鮮培養(yǎng)基，待感染細胞增長至80%以上密度后，進行嘌呤霉素壓力篩選。篩選3 d后檢驗陽性細胞純度。

三、檢驗RFP-GSC-1細胞純度

GSC-1和新建立的RFP-GSC-1細胞傳代培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，懸浮培養(yǎng)于添加0.04 ng/ml EGF、1 μl/ml bFGF、0.02 ml/ml B27的DMEM/F12干細胞培養(yǎng)液中。選取對數生長期的RFP-GSC-1細胞和對照組GSC-1細胞，消化、離心，收集細胞于離心管中，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline, PBS)漂洗3遍，并轉移至流式上樣管中備上機。細胞終濃度為1～2×106個/ml。細胞采用Beckman-Coulter公司CXP anlysis進行流式細胞(Flow Cytometry, FCM)分析。

四、裸鼠皮下荷瘤模型

收集處于對數期生長的RFP-GSC-1細胞，調整為密度1×106/ml的單細胞懸液懸于不含血清的DMEM培養(yǎng)基中，取200 μl細胞懸液接種于裸鼠背側肩胛部皮下。待腫瘤直徑2～3 mm時取瘤，中性福爾馬林固定后石蠟包埋，按5 μm厚度切片。

五、CD34免疫熒光染色

移植瘤標本石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，3%的雙氧水去除內源性過氧化物酶的影響， PBS洗3次×5 min，檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L, pH: 6.0)微波修復，室溫冷卻后PBS洗3次×5 min，山羊血清封閉20 min，滴加稀釋好的CD34(1 ∶1 000)，4℃濕盒內過夜，復溫30 min后PBS洗3次×5分鐘，Alexa Fluor@647孵育40 min后，PBS洗3次×5 min，現配4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染核3 min，PBS洗3次×5 min，抗淬滅劑封片。

結 果

一、RFP-GSC-1細胞系和綠色熒光鼠移植瘤模型的建立

建立的RFP-GSC-1細胞系(圖1 A, 白色箭頭)在培養(yǎng)過程中穩(wěn)定表達RFP(紅色熒光蛋白)。RFP-GSC-1細胞系純度達到98.8%(圖2B)，而對照組(未轉入RFP慢病毒的GSC-1細胞系)幾乎不表達紅色熒光(圖2A)。在熒光鼠移植瘤模型中可以觀察到在瘤體內部較少見到裸鼠的組織細胞，大部分以腫瘤細胞為主(圖1B)。在瘤體周邊可以觀察到較多的裸鼠組織細胞(圖1C)。

二、四通道熒光成像觀察熒光鼠RFP-GSC-1移植瘤微循環(huán)構筑

本次應用四通道熒光成像主要有：①405波長通道，為藍色，顯示DAPI染色的細胞核形態(tài)(圖3A)；②488波長通道，為綠色，顯示表達GFP的裸鼠細胞(圖3B)；③594波長通道，為紅色，顯示表達RFP的腫瘤細胞(圖3C)；④645波長通道，為黃色，顯示表達CD34的細胞(圖3D)。在觀察的5個標本中有1個標本中發(fā)現腫瘤來源的管道，其余四個標本都是以宿主來源管道為主。①通過微循環(huán)構筑模型的四通道熒光成像發(fā)現以熒光鼠細胞來源為主的微循環(huán)管道。其中裸鼠來源的GFP細胞分布在腫瘤周邊，而RFP細胞少量的散落在局限的區(qū)域(圖3E)，此外增加CD34標記物標記有內皮功能的細胞呈現黃色熒光(圖3D)。散在的大量供血管道中GFP細胞分布廣泛(圖3F, 白色箭頭)，而RFP細胞則分布較局限(圖3E)。大量GFP細胞表達CD34(圖3F, 白色箭頭)，也有部分RFP細胞表達CD34(圖3G, 白色箭頭)。②通過微循環(huán)構筑模型的四通道熒光成像觀察發(fā)現以腫瘤細胞來源為主的微循環(huán)管道(圖4)。其中裸鼠來源的細胞帶有GFP呈現綠色熒光(圖4B)，而腫瘤細胞帶有RFP呈現紅色熒光(圖4C)。此外增加CD34標記物標記有內皮功能的細胞呈現黃色熒光(圖4D)。在腫瘤區(qū)域普遍表達RFP，而中心血供處有散在表達GFP的裸鼠來源的細胞(圖4E, 白色箭頭)。GFP細胞構成其中一段微循環(huán)CD34+管道(圖4F, 白色箭頭)而RFP細胞在其周圍形成了許多環(huán)繞的CD34+管道結構(圖4G, 白色箭頭)。

圖1 RFP-GSC-1裸鼠移植瘤模型觀察

Fig 1 Observation of RFP-GSC-1 cells xenograft mouse model

A: RFP-GSC-1 cells expressed RFP; B: In the central area of tumor tissue, there were mainly RFP-GSC-1 cells (red); C: In the marginal area of tumor tissue, there were mainly mouse somatic cells (green).

Scale bar= 50μm.

圖2 RFP-GSC-1細胞純度檢驗

Fig 2 Purity of RFP-GSC-1 cells

A: GSC-1 of detection control group hardly expressed RFP; B: The purity of RFP-GSC-1 was 98.8%.

圖3 熒光鼠細胞來源為主的微循環(huán)管道

Fig 3 Microcirculation channels mainly formed by fluorescent mouse cells

A: DAPI stained for uncles, blue; B: Mouse somatic cells expressed GFP, green; C: Tumor cells expressed RFP, red; D: Endothelial cells expressed CD34, orange; E: In the marginal area of tumor tissue, there were mainly mouse somatic cells (white arrows); F: Mouse derived vessels expressed GFP and CD34 (white arrows); G: Tumor cells derived vessels expressed RFP and CD34 (white arrows); H: In the marginal area of tumor tissue, there were mainly mouse derived vessels after merged.

Scale bar 50 μm.

圖4 腫瘤細胞來源為主的微循環(huán)管道

Fig 4 Microcirculation channels mainly formed by tumor cells

A: DAPI stained for uncles, blue; B: Mouse somatic cells expressed GFP, green; C: Tumor cells expressed RFP, red; D: Endothelial cells expressed CD34, orange; E: In the central area of tumor tissue, there were mainly tumor cells (white arrows); F: Mouse derived vessels expressed GFP and CD34 (white arrows); G: Tumor cells derived vessels expressed RFP and CD34 (white arrows); H: In the central area of tumor tissue, there were mainly tumor cells derived vessels after merged.

Scale bar 50 μm.

討 論

本次研究建立了RFP-GSC-1細胞系和熒光鼠移植瘤模型。RFP-GSC-1細胞系是之前研究得到的膠質瘤干細胞系GSC-1[7]基礎上加入穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白基因而得到。在活細胞熒光成像中有獨到的示蹤作用，彌補其它各種染色示蹤辦法只能針對固定處理后的失活細胞的不足。同時，RFP-GSC-1細胞系拓展了傳統(tǒng)活細胞成像的觀察范圍[9]，不僅從形態(tài)方面進行記錄，還可以實時監(jiān)測細胞表面分子標記物的變化。近年新興的體內腫瘤細胞示蹤技術可以直觀的觀察腫瘤生長、侵襲和轉移[10]。我們同樣建立了RFP-GSC-1熒光鼠移植瘤模型，為之后體內腫瘤生物學特性動態(tài)觀察奠定基礎。RFP-GSC-1熒光鼠移植瘤模型可以有效區(qū)別移植瘤和裸鼠來源的細胞，排除腫瘤標記物的相對特異性的局限，滿足四通道熒光觀察的條件。

在傳統(tǒng)免疫熒光雙染方法中，CD34+細胞中部分具有明顯核異型性的細胞來源不明。因此很難客觀的闡述宿主來源的血管和腫瘤細胞形成的管道之間關系。RFP-GSC-1熒光鼠移植瘤模型更加精確的反映膠質瘤中微循環(huán)的構筑，加之CD34免疫熒光染色，能充分展示腫瘤中管道的位置以及管壁細胞的來源。我們本研究結果顯示，在腫瘤的邊緣部分主要是裸鼠來源的血管提供腫瘤營養(yǎng)。而在腫瘤內部可以觀察到以腫瘤細胞為主構成的管道。CD34+管道的管壁細胞有腫瘤來源的細胞和裸鼠來源的細胞共同構成。

多通道熒光成像技術[11]可以更細致的描述細胞分子水平的狀態(tài)和變化。之前的熒光成像研究通常是雙熒光[12]、甚至三熒光染色[13]。本次研究應用了四通道熒光成像技術來展示腫瘤細胞的生長及分子表型變化，首次結合熒光鼠和熒光腫瘤加之免疫熒光染色，有效的區(qū)別腫瘤來源細胞、裸鼠來源細胞，探索腫瘤生長過程中分子表型變化，排除裸鼠來源細胞在觀察中的影響。此外RFP-GSC-1熒光鼠移植瘤模型配合多通道熒光成像技術為活體熒光成像[14]提供基礎，結合新型的體內熒光探針顯像技術[15]在未來可以在活體內觀察腫瘤分子表型，為腦膠質瘤精準治療提供可行的動物實驗模型。

我們本研究在五個移植瘤中發(fā)現一個具有移植瘤細胞來源的血管形成，提示，移植瘤的血管主要是宿主來源細胞為主的管道，但同時也存在腫瘤細胞來源的管道，尤其是在腫瘤中央區(qū)域。其機制尚不完全明了，但推測可能是腫瘤中央區(qū)域由于缺氧等因素誘導腫瘤細胞向內皮細胞分化，形成管道，起到微循環(huán)的補償作用。

致謝：感謝蘇州大學附屬第二醫(yī)院黃強教授等提供Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU小鼠及相關技術指導。

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Identificationoftheglioblastomavascularorigincellthroughfour-channelimmunofluorescentimaging

MEIXin1,ZHANGQingping2,CHENJianliang2,CHENYinsheng1,ZHANGJie3,CHENFurong1,CHENZhongping1

1DepartmentofNeurosurgery,SunYat-senUniversityCancerCenter,Guangzhou510060;2DepartmentofNeurosurgery,FourthPeople'sHospitalofShenzhen,Shenzheng518000;3DepartmentofNeurosurgery,FirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Soochow215000, China

ObjectiveThere was a controversy of whether the blood vascular in glioma initiating from host or tumor cell. Our previous study demonstrates that endothelial differentiation capacity of glioma stem cells (GSC-1 cells). The study aims to probe deeply into the origin of the blood vascular in glioma.MethodsGSC-1 cells were labeled by red fluorescent protein (RFP-GSC-1) and transplanted into green fluorescent mouse. The 5 xenograft samples were stained by CD34 (endothelial marker) immunofluorescence (IF) and were observed under four channels immunofluorescence imaging microscope.ResultsThe RFP-GSC-1 cells were established and expressed RFP stably. The xenograft samples were scanned under four channels immunofluorescence imaging microscope. The result showed that the host-derived vessels were the main blood supply system of xenograft tissue. However, one of five samples contained tumor-derived vessels in the central region of xenograft tissue.ConclusionThis study reveals that the majority of blood supply vessels are the host-derived but tumor cell is also an origin of blood vessels in glioma.

Glioblastoma; Fluorescent mouse; Immunofluorescence

1671-2897(2016)15-221-05

·論著·

R 739.41

A

國家自然科學基金資助項目(81372685)；國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)資助項目(2015CB755505)；廣東省自然科學基金資助項目(S2013040012894)；廣東省科技計劃項目資助項目(2013B021800067)；深圳市科技計劃項目資助項目(JCYJ20140416094330210)

梅鑫，博士研究生，E-mail: meixin@sysucc.org.cn

*通訊作者： 陳忠平，教授、主任醫(yī)師，E-mail:chenzp@sysucc.org.cn

2016-01-01；

2016-03-30)