翟 瑩，張 軍，趙 艷，高士童，孫婉姝，張 闖，任巍巍，王秀文，王玉書

(1.齊齊哈爾大學 生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.黑龍江省獸醫(yī)科學研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

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大豆5個新發(fā)現ERF基因的生物信息學及表達分析

翟 瑩1，張 軍2，趙 艷1，高士童1，孫婉姝1，張 闖1，任巍巍1，王秀文1，王玉書1

(1.齊齊哈爾大學 生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.黑龍江省獸醫(yī)科學研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

ERF轉錄因子廣泛存在于植物中并且參與植物對生物及非生物脅迫的響應。從NCBI數據庫中獲得5個新的ERF基因，GmERFa/b/c/d/e。蛋白序列分析顯示，5個ERF基因均含有一個保守的AP2/ERF結合域。進化分析表明，GmERFe與GmERF3和GmERF7同源性最高，GmERFb、GmERFc與GmERF5的同源性最高，GmERFd與GmEREBP1的同源性較高，而GmERFa與其他ERF蛋白的同源性均較低。實時熒光定量PCR結果顯示，5個基因都主要在大豆的根和葉中表達。逆境處理后的實時熒光定量PCR結果顯示，GmERFd/e主要對乙烯信號和低溫產生響應，GmERFb主要對干旱產生響應，而GmERFa主要對低溫產生響應。

大豆；ERF轉錄因子；生物信息學分析；表達分析

乙烯響應因子(ethyleneresponsefactor，ERF)基因以家族形式廣泛存在于植物中，隸屬于AP2/ERF超家族。它們功能多樣，不僅在植物的生長和發(fā)育過程中發(fā)揮功能，更在植物應對不良環(huán)境時發(fā)揮重要作用[1-3]。ERF轉錄因子家族的成員都含有一段由58或59個氨基酸殘基組成的保守序列，即ERF的DNA結合域。ERF轉錄因子能夠識別并結合GCC-box、DRE/CRT等順式作用元件就取決于DNA結合域中特定的氨基酸序列，而這些順式作用元件則通常位于脅迫相關的啟動子中[4-7]。除此以外，ERF蛋白還可以與其他蛋白相互作用，包括bZIP轉錄因子蛋白，共同調控相關基因的表達[8-9]。多數ERF都是轉錄激活子調控相關基因的表達[10-12]，少數ERF則作為轉錄抑制子，它們不僅可以抑制相關基因的表達，還能夠降低其他轉錄因子的轉錄激活活性[10，13]。ERF抑制子的轉錄抑制活性通常與位于ERF蛋白C末端的EAR(ERF-associatedamphiphilicrepressor)元件相關，這是一段保守的L/FDLNL/F(X)P序列。EAR元件中的保守氨基酸若發(fā)生突變或整體失去，將導致抑制活性的喪失[14]。

研究表明，ERF轉錄因子可以被多種逆境及逆境相關的信號分子誘導表達，例如高鹽、干旱、低溫、脫落酸(ABA)、乙烯(ET)、茉莉酸和水楊酸等[12-13]。將它們在植物中過量表達可以提高轉基因植株對多種生物及非生物脅迫的綜合抗性[12-13，15]。植物中存在大量的ERF基因，僅大豆中就發(fā)現了98個包含有完整AP2/ERFDNA結合域的獨立基因[16]。但這些基因在功能上存在冗余性，因此有必要對大豆ERF家族中其他成員作進一步鑒定。本研究從基因數據庫中搜索到5個功能未鑒定的大豆ERF轉錄因子基因，對它們進行生物信息學分析并對它們在不同組織及逆境脅迫下的表達模式進行鑒定，以期揭示大豆中ERF的抗逆機制并豐富大豆抗逆基因資源，為后續(xù)植物ERF基因的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

大豆品種合豐46由齊齊哈爾大學遺傳研究室保存。對盆栽的四葉期大豆幼苗進行以下逆境處理。參照Zhai等[13]的方法用ET和ABA處理大豆幼苗；將大豆幼苗置于含20%PEG8000的MS營養(yǎng)液中進行干旱處理；置于含200mmol·L-1NaCl的MS營養(yǎng)液中進行高鹽處理；置于4 ℃培養(yǎng)箱中進行低溫處理。分別在處理0、1、2、5、10和24h取樣，剪取0.1g葉片并迅速置于液氮中保存?zhèn)溆?。同時剪取大豆的根、莖、花和未成熟胚置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生物信息學分析

用已知的ERF基因保守序列[12]搜索NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得功能未知的大豆ERF基因完整序列；用在線軟件PSORT(http://psort.hgc.jp/)進行核定位信號的預測；用DNAMAN軟件構建ERF蛋白系統進化樹。

1.3 表達模式分析

根據5個ERF的基因序列，使用Primer5軟件設計實時熒光定量PCR引物(表1)。在BIO-RADCFX96Real-TimePCR儀上，以大豆組成型表達基因β-Tubulin (GenBank登錄號為GMU12286)作為內參，以大豆不同組織的cDNA和不同處理時間點葉片cDNA為模板。反應體系為2×SYBRPremixExTaq (TaKaRa) 10μL、cDNA2μL、10μmol·L-1正反向引物各0.4μL、ROXReferenceDyeⅡ 0.2μL，補水至總體積20μL。

表1 所用引物序列

Table 1 Sequences of primers

基因Gene引物1Primer1引物2Primer2GmERFa5'-TCGCTGTTCCAAAGAAGACC-3'5'-CGAAGGTTCCGAGCCAAA-3'GmERFb5'-ACAGCGATTGCGACTCTTCT-3'5'-CGGATGGTGGGAGGTTTAG-3'GmERFc5'-ACTTTCTCCGCCGTTCTACC-3'5'-CGTCTCCGTCGTCCACAA-3'GmERFd5'-CCAAAGAATTTAAGTTAAACC-3'5'-GGTGTTGAATTGAATATTGGA-3'GmERFe5'-CCAAAGTTAGCGAGCAGGTT-3'5'-GGTGTTGTGGAGCGAAAGG-3'β-Tubulin5'-GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3'5'-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3'

反應程序：95 ℃預變性10 s；95 ℃變性 20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。所有處理均做3次重復，采用2-△△Ct法分析數據，計算出基因的相對表達量。利用BIO-RAD CFX Manager軟件對試驗結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 五個ERF基因的生物信息學

用ERF基因保守序列在NCBI數據庫中搜索獲得5條功能未知的大豆ERF基因序列，它們都包含完整的開放閱讀框(open reading frame， ORF)，將它們分別命名為ERFa/b/c/d/e。GmERFa(GenBank登錄號：HM219231) ORF全長828 bp，編碼275個氨基酸，蛋白序列中部含有一個由59個氨基酸組成的AP2/ERF結合域(圖1)，結合域外含有2個預測的核定位信號(R203KRRR和P219VVKKEK)。GmERFb(GenBank登錄號：BT096447) ORF全長648 bp，編碼215個氨基酸，蛋白序列中部含有一個由58個氨基酸組成的AP2/ERF結合域(圖1)，結合域內含有兩個預測的核定位信號(R31KRP和P45WKKQRV)。GmERFc(GenBank登錄號：XM003551818) ORF全長639 bp，編碼212個氨基酸，靠近蛋白序列N端含有一個由58個氨基酸組成的AP2/ERF結合域(圖1)，結合域內含有2個預測的核定位信號(R32KRP和P46LKKARV)。GmERFd(GenBank：XM003538704) ORF全長810 bp，編碼269個氨基酸，靠近蛋白序列C端含有一個由59個氨基酸組成的AP2/ERF結合域(圖1)，結合域外含有1個預測的核定位信號(K262KRKK)。GmERFe(GenBank登錄號：NM001254494) ORF全長903 bp，編碼300個氨基酸，靠近蛋白序列N端含有一個由58個氨基酸組成的AP2/ERF結合域(圖1)，結合域外含有1個預測的核定位信號(P66VKRQRK)。

圖1 五個ERF蛋白的AP2/ERF結合域Fig.1 AP2/ERF binding domains of 5 ERF proteins

將這5個ERF蛋白與GenBank中功能已經鑒定的6個大豆ERF蛋白構建系統進化樹，進行系統發(fā)育分析。結果如圖2所示，GmERFe與GmERF3和GmERF7同源性最高，在它們蛋白的N端均含有一個功能未知的MCGGAI(I/L)元件，推測GmERFe功能上與GmERF3和GmERF7相似，均為轉錄激活子；GmERFb、GmERFc與GmERF5的同源性最高，在它們蛋白的C端均含有一個EAR抑制元件，推測GmERFb和GmERFc功能上與GmERF5相似，均為轉錄抑制子；此外，GmERFd與GmEREBP1的同源性較高，而GmERFa與其他ERF蛋白的同源性均較低。

2.2 五個ERF基因的組織表達

實時熒光定量PCR檢測5個ERF基因在大豆不同組織中的表達情況。結果顯示，5個基因都主要在大豆的根和葉中表達，其中GmERFb/c/e在根中的表達量高于葉，而GmERFa/d在葉中和根中的表達量無明顯差異(圖3)。此外，GmERFb在胚中基本不表達；GmERFc在花中的表達量也比較高，僅次于根中的表達量。以上結果表明ERF轉錄因子基因可能主要在大豆的根部和葉片中行使一定的調控功能。

GmEREBP1: AAM45475; GmERF3: NP001238300; GmERF4: ACE76905; GmERF5: AEX25891; GmERF6: AEQ55267; GmERF7: AEQ55266圖2 系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree

圖3 五個ERF基因在大豆不同組織中的表達Fig.3 Expression of 5 ERF genes in soybean tissues

2.3 五個ERF基因在逆境處理條件下的表達

用ABA、ET、干旱、高鹽和低溫處理大豆幼苗，通過實時熒光定量PCR檢測5個ERF基因在逆境下的表達動態(tài)。結果顯示，ABA處理后，除了GmERFa和GmERFc在1 h有升高外，其他均有所下降(圖4-A)；ET處理后，5個基因的表達量均有所升高，GmERFa/b/c的表達量升高不明顯，GmERFd和GmERFe的表達量升高較為明顯，均在處理2 h達到最大值，分別是對照的20倍和11倍(圖4-B)；干旱處理后，5個基因的表達趨勢較為一致，均是先降低后升高，在處理24 h時達到最大值(圖4-C)；高鹽處理后，5個基因的表達量均隨時間延長有所下降(圖4-D)；低溫處理后，5個基因均呈現先升高后降低的趨勢，GmERFa/b/c的表達量在1 h達到最大值，GmERFd和GmERFe的表達量在2 h達到最大值(圖4-E)。

3 討論

植物在一生中總會遇到各種各樣的生物及非生物脅迫(例如病原侵染、干旱、極端溫度和鹽堿等)。作為對不良環(huán)境的應答，植物會在染色體DNA、轉錄及轉錄后3個水平上精確調控相關基因的表達[17]。轉錄因子通過與啟動子中順式作用元件的特異結合可以在轉錄水平上調控下游基因的表達。ERF轉錄因子是一個龐大的基因家族，不同的ERF轉錄因子對于基因的轉錄調控既存在差異，又存在功能冗余。

圖4 五個ERF基因在ABA(A)、ET(B)、干旱(C)、鹽分(D)、低溫(E)處理下的表達Fig.4 Expression of 5 ERF genes in ABA (A)， ET (B)， drought (C)， salt (D) and low temperature (E) treatment

根據Tournier等[18]的分類方法，ERF轉錄因子分4個亞類，第Ⅱ亞類中的ERF均為轉錄因抑制子，都含有EAR抑制元件。所以推測本研究中GmERFb和GmERFc應為轉錄抑制子，而GmERFa/d/e不含EAR元件，應為轉錄激活子。核定位預測結果顯示5個ERF基因均含有1～2個預測的核定位信號，這與以往鑒定的ERF轉錄因子定位于細胞核中的結果相一致[7，19]。這是因為轉錄因子雖在細胞質中合成，但卻在細胞核中發(fā)揮轉錄調控作用。

植物在遭受生物和非生物脅迫時最先感知的就是根和葉片，所以逆境相關的基因主要在根和葉片中發(fā)揮作用，這與本研究中5個ERF主要在根和葉中表達相一致。本文中的5個ERF基因對逆境脅迫的應答并不一致，這與前人發(fā)現的擬南芥中不同的ERF成員在脅迫下具有不同表達模式的研究結果相一致[10]。表明不同的ERF基因對相同或不同的逆境均存在不同的應答機制。轉錄因子之所以會對不同的逆境信號產生不同的響應，可能是由于DNA結合特性不同或者是存在翻譯后水平調控， 也有可能是與不同蛋白相互作用的結果[20]。根據實時熒光定量PCR的結果，5個ERF基因中，GmERFd/e主要對乙烯信號和低溫產生響應，GmERFb主要對干旱產生響應，而GmERFa主要對低溫產生響應，可進行進一步研究。

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(責任編輯 張 韻)

Bioinformaticsandexpressionanalysisof5newfoundERFgenesinsoybean

ZHAIYing1，ZHANGJun2，ZHAOYan1，GAOShi-tong1，SUNWan-shu1，ZHANGChuang1，RENWei-wei1，WANGXiu-wen1，WANGYu-shu1

(1. College of Life Science and Agro-forestry， Qiqihar University， Qiqihar 161006， China；2. Heilongjiang Institute of Veterinary Science， Qiqihar 161005， China)

ERFtranscriptionfactorsarewidespreadinplants，whicharewidelyinvolvedinplantresponsetobioticandabioticstress.Inthisstudy，fivenovelERFgenesequences， ERFa/b/c/d/e，wereobtainedbyblastfromNCBIdatabase.ProteinsequencesanalysisshowedthatthefiveERFproteinsallcontainedatypicalAP2/ERFbindingdomain.PhylogeneticanalysisindicatedthatGmERFewashighlyhomologoustoGmERF3andGmERF7;GmERFbandGmERFcwerehighlyhomologoustoGmERF5;GmERFdwashomologoustoGmEREBP1;whileGmERFahadlowerhomologywithotherERFproteins.TheexpressionpatternsoffiveERFgenesinsoybeantissuesandunderstresstreatmentswereanalyzedbyreal-timequantitativePCR.TheresultsshowedthatthefiveERFgenesexpressedhighlyinrootandleaf.GmERFd/erespondedmainlytoethylenesignalandlowtemperature，GmERFbrespondedmainlytodrought，andGmERFarespondedmainlytolowtemperature.

soybean;ERFtranscriptionfactor;bioinformaticsanalysis;expressionanalysis

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.10.03

2016-02-16

國家自然科學基金項目(31301335)；黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12541889);黑龍江省自然科學基金項目(C201458)

翟瑩(1982—)，女，吉林吉林人，講師，博士，主要從事植物分子育種研究。E-mail: fairy39809079@126.com

S

A

浙江農業(yè)學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(10): 1644-1649

翟瑩，張軍，趙艷，等. 大豆5個新發(fā)現ERF基因的生物信息學及表達分析[J].浙江農業(yè)學報，2016，28(10)： 1644-1649.