潘建義，成 浩，王麗鴛，馬軍輝， 陳香云

(1.浙江省麗水市農(nóng)業(yè)局 農(nóng)作物站， 浙江 麗水323000； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所/國家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008； 3.江蘇省南京市高淳區(qū)林業(yè)工作站，江蘇 南京211300)

?

基于化學(xué)指紋圖譜的茶樹新品系麗早香識別研究

潘建義1，成 浩2，*，王麗鴛2，馬軍輝1， 陳香云3

(1.浙江省麗水市農(nóng)業(yè)局 農(nóng)作物站， 浙江 麗水323000； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所/國家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008； 3.江蘇省南京市高淳區(qū)林業(yè)工作站，江蘇 南京211300)

化學(xué)指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于茶樹研究可用于其身份、產(chǎn)地的判別。茶樹品種間差異鑒別是申請農(nóng)作物新品種審定的重要內(nèi)容，試驗利用HPLC檢測分析麗早香、龍井43、迎霜和當(dāng)?shù)厝后w的化學(xué)組成及比例，構(gòu)建化學(xué)指紋圖譜，從而區(qū)分麗早香品系。通過HPLC測定樣品色譜數(shù)據(jù)，選擇90%以上樣品中存在的峰為樣本集的共有峰，建立數(shù)字化多元化學(xué)指紋圖譜。麗早香在圖譜相似性上與當(dāng)?shù)厝后w最高；在兒茶素、咖啡堿、沒食子酸等茶葉主要化學(xué)組成比例上，與對照不同，可以與龍井43、迎霜、當(dāng)?shù)厝后w辨別區(qū)分，為茶樹品種間差異鑒別和申請植物新品種保護(hù)提供借鑒。

茶樹；麗早香；化學(xué)指紋圖譜；識別分析

化學(xué)指紋圖譜技術(shù)在中藥等領(lǐng)域用于評價材料品質(zhì)、道地性、產(chǎn)地等已有許多成功的應(yīng)用案例[1-3]。近年來，該技術(shù)在茶樹上應(yīng)用研究并用于身份、產(chǎn)地判別已經(jīng)有相關(guān)報道[4-11]。麗早香是浙江麗水市選育出來的早生茶樹新品系，其早生優(yōu)質(zhì)特別適制螺形顯毫名茶(如金獎惠明、蘇州碧螺春、南京雨花茶)和扁形名茶、半烘炒香茶等名優(yōu)綠茶和工夫紅茶，該品系多適制性在生產(chǎn)上給茶農(nóng)帶來良好經(jīng)濟效益而為茶農(nóng)迅速接受，具有較大開發(fā)利用價值。本文運用HPLC建立多元化學(xué)指紋圖譜，并結(jié)合判別技術(shù)，明確麗早香與其他品種特別是主栽品種的差異， 為茶樹品種間差異鑒別提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗采用干茶樣本材料76個，由浙江省麗水市蓮都區(qū)、景寧縣、遂昌縣、松陽縣、縉云縣等地的13個茶場(廠)以扁型茶制作工藝加工制作，原料品種除了麗早香(LZX)外，以本地主栽品種龍井43(LJ)、迎霜(YS)和當(dāng)?shù)伉F坑群體種(QT)作為對照；鮮葉采樣標(biāo)準(zhǔn)為春季第一輪新梢的一芽一葉相同品種隨機采樣；茶樣制作完成后冷藏干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀(Agilent 公司，含四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器)；DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司)；表沒食子酸兒茶素( EGC，純度>99%) 、兒茶素( C，純度>99%) 、表兒茶素(EC，純度>99%)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG，純度>99%)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG，純度>99%)、咖啡堿(Caffeine，純度>99%)、沒食子酸(GA)均購自美國Sigma公司；色譜乙腈(德國Merck公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品提取方法

參考王麗鴛等[5-6]方法，干茶樣粉碎后，精密稱取3 g，50%乙醇室溫浸提15 min，過濾，濾渣洗滌3次后合并濾液，用容量瓶定容至100 mL[12]，過0.22 μm濾膜，所得濾液用于HPLC分析。

1.3.2 HPLC方法

Phenomenex C12色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；色譜條件：(1)A相為1%甲酸；B相為乙腈；梯度從4% B到25% B，流速1 mL·min-1，60 min，檢測波長 280 nm；(2)A相為1%甲酸；B相為乙腈；梯度從10% B到30%B，流速1 mL·min-1，60 min。柱溫40 ℃，檢測波長365 nm[6]。

1.3.3 指紋圖譜的建立

獲得色譜圖后，每個樣本的2個色譜圖分別以峰面積相對最大之主峰為參照，計算相對保留時間和相對峰面積；各峰按相對保留時間一一匹配后，選擇90%以上樣品中存在的峰為樣本集的共有峰，按多元信息融合原理將兩色譜圖以串行方式進(jìn)行像素級融合，最后選擇41個色譜峰數(shù)據(jù)建立起各樣本的數(shù)字化多元化學(xué)指紋圖譜[5-6,12]。

1.3.4 組成比例、模式圖譜與相似度計算

樣本材料按品種分為4組，求取同組樣本的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，Excel作圖分析。用同組樣本的平均值構(gòu)建該組樣本的模式圖譜；利用SPSS軟件，采用向量夾角法測算樣本與模式圖譜間或樣本間的相似度[5-6,12]。

1.3.5 品種間差異與判別分析

每組樣本以每隔3個樣本留1個的方法留出驗證樣本，其余作為訓(xùn)練樣本，進(jìn)行品種差異與判別研究。利用SPSS軟件，根據(jù)統(tǒng)計量Wilksλ最小值原則選擇變量，進(jìn)行逐步判別分析并建立判別方程；接著通過訓(xùn)練樣本的回代判別并計算回代錯判率，將每一樣本逐一從訓(xùn)練集中去掉，再用同樣方法判別分析，進(jìn)行內(nèi)部交叉驗證分析，驗證所建立方程的穩(wěn)定性。最終利用外部驗證樣本驗證判別方程的判別效果[4]，并采用判別方程數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本色譜間的相似度

將各樣本按品種分組后，計算出各品種的平均色譜數(shù)據(jù)，然后利用SPSS軟件以向量夾角法計算出各樣本與各品種平均色譜間的相似度，分析相關(guān)數(shù)據(jù)，可以看到絕大部分樣本都和其本身所屬的品種平均色譜間的相似度最高，經(jīng)數(shù)據(jù)分析剔除2個異常樣本后，各品種平均色譜的峰面積和相對峰面積見表1。按同樣原理，計算出各品種平均色譜之間的相似度見表2。從表中可以看出，4個品種材料間相似度最高的是麗早香和當(dāng)?shù)伉F坑群體種，其次是龍井43和當(dāng)?shù)伉F坑群體種，相似度最低的是龍井43和迎霜。

表1 各茶樹品種平均色譜的峰面積和相對峰面積

Table 1 Average chromatographic peak area and relative peak area of each tea variety

峰編號PeakNo.LJPARA/%QTPARA/%YSPARA/%LZXPARA/%X1234.582.8297.563.2346.293.0189.142.2GA1060.9712.7937.019.81034.078.6571.307.5X31509.3218.11328.7013.91526.6712.71272.1416.2X4215.532.7388.374.0398.193.3433.395.1EGC220.762.6184.191.9210.951.7186.292.4X7292.483.5257.192.8297.322.5214.632.7C266.393.2213.812.2213.171.8204.642.7X91168.8314.01456.5115.61090.449.1753.039.7caf7883.6294.68163.4785.18601.4671.57608.1095.8X12162.442.0237.372.4312.522.6157.091.9EC717.058.6544.415.7541.314.5687.119.1EGCG8366.95100.09710.87100.012108.66100.08256.62100.0X15482.495.8406.734.2246.272.0277.113.7GCG427.395.2285.823.0388.493.2323.224.2X171866.0122.31349.0314.32663.7922.91245.6115.1X18481.355.7579.546.2455.153.8205.852.6X21961.9811.2210.112.3202.601.7405.385.2X22368.484.4318.793.4263.632.2327.544.2ECG5486.3065.74187.3243.93157.6526.14862.9762.3X31247.1535.6206.8637.8115.7030.5193.3552.4X3270.9810.5107.6419.185.5822.2118.2733.9X33163.1723.1170.6030.744.6511.395.9124.4X34153.9423.5268.3148.7346.1591.3248.6071.4X35288.2542.8371.5973.7330.5691.4251.0874.5X36698.56100.0540.65100.0367.68100.0386.70100.0X37231.7833.9230.6742.057.8115.2183.0150.7X3842.147.1113.4820.866.7717.8145.4745.0X39252.1238.6420.8278.1847.71227.0486.42145.3X40321.8346.8253.4046.8154.0641.1293.4982.4X4131.655.276.2113.783.6422.2141.8744.9

LJ，龍井43；QT，當(dāng)?shù)伉F坑群體種；YS，迎霜；LZX，麗早香；PA，峰面積；RA，相對面積。

LJ， Longjing 43; QT， Jiukeng; YS， Yingshuang; LZX， Lizaoxiang; PA， Peak area; RA， Relative area.

表2 各茶樹品種平均色譜間的相似度

Table 2 The degree of similarity between average chromatographic data of each tea variety

品種VarietyLJQTYSLZXLJ1.0000.9490.7190.851QT1.0000.8710.952YS1.0000.930LZX1.000

LJ，龍井43；QT，當(dāng)?shù)伉F坑群體種；YS，迎霜；LZX，麗早香。

LJ， Longjing 43; QT， Jiukeng; YS， Yingshuang; LZX， Lizaoxiang.

2.2 生化組成與比例

圖1所示的是各品種的兒茶素單體含量，以及它們的沒食子酸和咖啡堿含量。從圖中可以看出，各品種之間相差較大的主要是EGCG和ECG等酯型兒茶素成分含量，其中迎霜的EGCG含量較高，同時ECG含量相對較低。而麗早香的兩種酯型兒茶素含量均與龍井43在一個等級上，EGCG低于迎霜，而ECG高于迎霜。

LJ，龍井43；QT，當(dāng)?shù)伉F坑群體種；YS，迎霜；LZX，麗早香LJ，Longjing 43； QT，Qunti； YS: Yingshuang； LZX，Lizaoxiang圖1 各茶樹品種的兒茶素單體、沒食子酸和咖啡堿含量Fig.1 The contents of catechin monomer， garlic acid and caffeine of each tea variety

圖2所示的是4個品種的兒茶素單體、沒食子酸和咖啡堿構(gòu)成比例。從圖中可以看出，組成比例最為穩(wěn)定的成分是咖啡堿，不論哪個品種都是34%左右。組成比例變化最大的是EGCG，其幅度為35%～47%。而麗早香各成分組成比例與龍井43比較相似，與迎霜相差較大。

2.3 各茶樹品種模式圖譜的建立

將2個色譜圖按信息融合原則進(jìn)行合并后，計算出相對保留時間和相對峰面積，按相對保留時間對每個樣本的色譜峰進(jìn)行一一匹配后，選擇90%以上樣本共有的峰為樣本集共有峰，并去除相對峰面積過小的峰，最終得到每個樣本的化學(xué)指紋圖譜并通過求取平均構(gòu)建各組樣本的模式圖譜如圖3。從這些模式圖譜中可以比較形象直觀地看出各個不同品種在生化組成方面的差異。

LJ，龍井43；QT，當(dāng)?shù)伉F坑群體種；YS，迎霜；LZX，麗早香LJ， Longjing 43; QT， Jiukeng; YS， Yingshuang; LZX， Lizaoxiang圖2 各茶樹品種兒茶素單體、沒食子酸和咖啡堿比例Fig.2 The proportion of catechin monomer， garlic acid and caffeine of each tea variety

圖3 各茶樹品種的模式圖譜比較Fig.3 Fingerprint pattern of each tea variety

2.4 品種差異的判別

采用各品種組選出的訓(xùn)練集樣本，利用SPSS軟件計算進(jìn)行逐步判別分析，根據(jù)計算得出的非標(biāo)準(zhǔn)化判別方程系數(shù)，得到判別方程組，包含3個判別方程，它們的變量和各項系數(shù)見表3。判別函數(shù)F1、F2和F3的特征值分別為96.46、35.81和16.33，典型相關(guān)系數(shù)分別為0.995、0.986和0.971，對判別結(jié)果的方差分析表明，類間差異明顯(P<0.0001)，即判別結(jié)果有效。

將57個訓(xùn)練集樣本再逐一代入判別方程，所有的樣本都成功地判別為其正確的品種，回判成功率為100%。再將每一樣本逐一從訓(xùn)練集中去掉后，重新建立判別方程組并做判別分析，進(jìn)行內(nèi)部交叉驗證分析，用于驗證建立的方程組的穩(wěn)定性，所有樣本的內(nèi)部交叉驗證都成立，其正確率同樣是100%。最后將17個外部驗證樣本逐一代入進(jìn)行判別分析，只有一個麗早香的樣本被錯判為當(dāng)?shù)伉F坑群體種，正確判別率為94.1%。分析錯誤原因，主要是麗早香的有效樣本數(shù)量只有8個，數(shù)量太少，因此它的訓(xùn)練集還沒能完全綜合出這個品種的特性。

訓(xùn)練集和驗證集樣本的判別結(jié)果和判別函數(shù)X3、X9、EC……X41分別代表不同相對保留時間色譜峰的相對峰面積。

表3 逐步判別分析得到的判別方程式組的各項系數(shù)

Table 3 The coefficient of discriminant equation group by Stepwise discriminant analysis

自變量Independentvariable系數(shù)Coefficient方程式1Formula1方程式2Formula2方程式3Formula3常數(shù)項-23.24-5.074.99X327.9117.53-24.62X9-19.2716.0052.79EC135.8380.0027.06X18-48.48-65.18-30.10ECG7.60-9.23-24.00X3114.29-0.36-8.29X32-21.71-14.8219.60X37-20.43-3.28-1.86X3854.1325.2536.48X39-4.906.43-4.17X4029.69-10.418.35X41-14.713.17-24.00

X3，X9，EC……X41 represents the relative peak area at different relative retention time， respectively.

得分見表3，為更直觀體現(xiàn)判別分析的結(jié)果，將3個判別函數(shù)的得分值兩兩作圖(圖4)，從圖4可以看出，判別分類的效果很好，不同的品種都分布在不同的區(qū)域，相互間的界限明顯，只有被錯判的那個麗早香樣本的位置與其他麗早香樣本較遠(yuǎn)。

圖4 判別函數(shù)得分值的分布圖Fig.4 The layout of score values of discriminant function

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，從兒茶素單體組成來看，麗早香與龍井43比較接近，但從整個化學(xué)指紋圖譜的相似性來看，麗早香與當(dāng)?shù)伉F坑群體種的相似度更高，與生產(chǎn)實踐中反映的麗早香感官品質(zhì)色香味形及適制性與當(dāng)?shù)伉F坑群體相當(dāng)這一現(xiàn)象一致。從化學(xué)指紋圖譜模式圖上，可以清楚地看出麗早香與龍井43、當(dāng)?shù)伉F坑群體種和迎霜在主要生化組成與比例上不同。通過判別分析，可以將麗早香與其他3個品種的樣本很好地辨別區(qū)分。

[1] 沈偉， 張一文， 李赫宇. 大川芎方 HPLC 指紋圖譜方法學(xué)研究[J]. 食品研究與開發(fā)， 2015， 36(18): 159-161.

SHEN W， ZHANG Y W， LI H Y. The HPLC fingerprint analysis of dachuanxiong formula[J].FoodResearchandDevelopment， 2015， 36(18):159-161.(in Chinese with English abstract)

[2] 李靜， 喬媛媛， 魏屹，等. 四川地區(qū)峨?yún)⒏咝б合嘀讣y圖譜研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 41(10): 267-269.

LI J， QIAO Y Y， WEI Y， et al. The HPLC fingerprint analysis of wild chervil in Sichuan[J].JiangsuAgricultureSciences， 2013， 41(10): 267-269. (in Chinese with English abstract)

[3] 周建良， 齊煉文， 李萍. 色譜指紋圖譜在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J]. 色譜， 2008， 26(2): 153-159.

ZHOU J L， QI L W， LI P. Quality control of Chinese herbal medicines with chromatographic fingerprints[J].ChineseJournalofChromatography， 2008， 26(2): 153-159. (in Chinese with English abstract)

[4] 王麗鴛， 成浩， 周健，等. 基于多元化學(xué)指紋圖譜的武夷巖茶身份判別研究[J]. 茶葉科學(xué)， 2010， 30(2): 83-88.

WANG L Y， CHENG H， ZHOU J, et al. Discriminant classification of Wuyi Yan tea based on multiple chemical fingerprint[J].JournalofTeaScience， 2010， 30(2):83-88. (in Chinese with English abstract)

[5] 成浩， 王麗鴛， 周健，等. 基于化學(xué)指紋圖譜的扁形茶產(chǎn)地判別分析研究[J]. 茶葉科學(xué)， 2008， 28(2): 83-88.

CHENG H， WANG L Y， ZHOU J， et al. Discriminant classification of production area of flatten-shaped green tea based on multiple chemical fingerprint[J].JournalofTeaScience， 2008， 28(2):83-88. (in Chinese with English abstract)

[6] 王麗鴛， 成浩， 周健，等. 綠茶數(shù)字化多元化學(xué)指紋圖譜建立初探[J]. 茶葉科學(xué)， 2007， 27(4): 335-342.

WANG L Y， CHENG H， ZHOU J， et al. A preliminary attempt to establish the digital multiple chemical fingerprints of green tea[J].JournalofTeaScience， 2007， 27(4): 335-342. (in Chinese with English abstract)

[7] 程翼宇， 陳閩軍， 吳永江. 化學(xué)指紋圖譜的相似性測度及其評價方法[J]. 化學(xué)學(xué)報， 2002， 60(11): 2017-2021.

CHENG Y Y， CHEN M J， WU Y J. Measures for determining the similarity of chemical fingerprint and a method of evaluating the measures[J].ActaChemicalSinica， 2002， 60(11): 2017-2021. (in Chinese with English abstract)

[8] 黃丹娟， 馬建強， 陳亮. 茶樹 DNA 分子指紋圖譜研究進(jìn)展[J]. 茶葉科學(xué)， 2015， 35(6): 513-519.

HUANG D J， MA J Q， CHEN L. Research progress on DNA molecular fingerprinting of tea plant(Camelliasinensis) [J].JournalofTeaSciences， 2015， 35(6): 513-519. (in Chinese with English abstract)

[9] 劉英， 吳曙光， 尹州，等. 指紋圖譜技術(shù)在茶葉研究上的應(yīng)用[J]. 茶葉科學(xué)， 2013， 33(1): 13-20.

LIU Y， WU S G， YIN Z， et al. Application of fingerprint technique in tea research[J].JournalofTeaSciences， 2013， 33(1): 13-20. (in Chinese with English abstract)

[10] 范杰文， 羅一帆， 凌彩金. 茶葉指紋圖譜研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 40(14): 228-231.

FAN J W， LUO Y F， LING C J. Research progress of tea fingerprint[J].GuangdongAgricultureSciences， 2013， 40(14): 228-231. (in Chinese with English abstract)

[11] 賀巍. 基于化學(xué)指紋圖譜的茶葉產(chǎn)地、原料品種判別分析和生化成分預(yù)測[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2011.

HE W. Discriminant analysis of production regions and tea plant cultivars， and prediction of chemistry components based on chemical fingerprint[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University， 2011. (in Chinese with English abstract)

[12] 成浩， 王麗鴛， 周健，等. 基于化學(xué)指紋圖譜的綠茶原料品種判別分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2008， 41(8): 2413-2418.

CHENG H， WANG L Y， ZHOU J， et al. Discriminant classification of green tea’s raw material cultivar based on multiple fingerprint[J].ScientiaAgriculturaSinica， 2008， 41(8):2413-2418. (in Chinese with English abstract)

(責(zé)任編輯 張 韻)

Identification and characterization of new tea line Lizaoxiang based on chemical fingerprint

PAN Jian-yi1， CHENG Hao2，*， WANG Li-yuan2， MA Jun-hui1， CHEN Xiang-yun3

(1.CropWorkstationofAgricultureBureauofLishui，Lishui323000，China; 2.TeaResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalSciences，NationalCenterforTeaImprovement，Hangzhou310008，China; 3.ForestWorkstationofGaochunDistrictofNanjing，Jiangsu，Nanjing211300，China)

Chemical fingerprint technology has widely been implicated for discriminating the identity and origin of tea plant. Difference identification between tea plant cultivars is important for applying for new variety certification. In the current study， we analyzed the chemical composition and proportion of bioactive compounds using HPLC and built a chemical fingerprint to distinguish Lizaoxiang from Longjing 43， Yingshuang and Jiukeng. On the basis of the obtained HPLC chromatographic data， we selected common peak data of more than 90% samples to build chemical fingerprint chromatograph for further analysis. Chromatography revealed that Lizaoxiang was closest to Jiukeng；while the proportion of catechins， gallic acid and caffeine was different from that of Longjing 43， Yingshuang and Jiukeng. These observations help to distinguish Lizaoxiang from Longjing 43， Yingshuang and Jiukeng， and thus provid reference to characterize the difference between the varieties of tea plant for new variety protection.

tea; Lizaoxiang; chemical fingerprint; identification analysis

http://www.zjnyxb.cn潘建義，成浩，王麗鴛，等. 基于化學(xué)指紋圖譜的茶樹新品系麗早香識別研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28(10)： 1724-1729.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.10.14

2016-06-16

浙江省茶產(chǎn)業(yè)重點科技創(chuàng)新團隊(2011R50024)；麗水市優(yōu)質(zhì)特早紅綠兼制型茶樹新品種選育研究(2014XPZ11)

潘建義(1968—)，男，浙江溫州人，碩士，高級農(nóng)藝師，主要從事茶葉技術(shù)推廣及茶樹品種研究。 E-mail: pjy369@126.com

*通信作者，成浩，E-mail: chenghao@mail.tricaas.com

S571.1

A

1004-1524(2016)10-1724-06

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(10): 1724-1729