凡軍民， 賈 君，謝春芹， 韓艷麗

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇句容 212400)

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氣相色譜法測(cè)定蟬花中角鯊烯的含量

凡軍民， 賈 君*，謝春芹， 韓艷麗

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇句容 212400)

[目的]建立毛細(xì)管氣相色譜(GC)測(cè)定蟬花中角鯊烯含量的方法。[方法]采用氣相色譜法測(cè)定蟬花中角鯊烯，并對(duì)不同部位天然蟬花的角鯊烯含量進(jìn)行比較，確定蟬花中角鯊烯含量測(cè)定的最佳條件。[結(jié)果]1 g蟬花經(jīng)超聲波提取后，經(jīng)1 mL 0.5 mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液40 ℃皂化5 min，再經(jīng)正已烷萃取凈化，采用GC法測(cè)定角鯊烯含量。該方法在角鯊烯質(zhì)量濃度為21.43～214.30 μg/mL(r=0.999 2) 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法精密度良好(RSD=3.71%)，加標(biāo)回收率為77.80%～97.32%，平均加標(biāo)回收率(n=9)為88.10%。[結(jié)論]氣相色譜法簡(jiǎn)單快速，污染小，檢測(cè)靈敏度高，可用于蟬花中角鯊烯含量的測(cè)定。

蟬花；角鯊烯；氣相色譜法

蟬花(CordycepscicadaeShing)是一些蟬的土棲若蟲受到蟬擬青霉(PaecilomyescicadaeSamson)真菌寄生的產(chǎn)物，與名貴中藥材冬蟲夏草的無(wú)性系同屬，金蟬花可以作為冬蟲夏草的代用品，起到滋補(bǔ)養(yǎng)生的作用[1]。研究表明，蟬花含有多種活性成分，具有調(diào)節(jié)免疫功能和脂類代謝，改善機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀況，抗疲勞、解熱鎮(zhèn)痛和滋補(bǔ)強(qiáng)壯等作用[2]。

角鯊烯又名鯊烯、鯊萜，是所有細(xì)胞中甾醇的前體，不飽和程度較高，是一種非常重要的功能油脂[2-3]。角鯊烯具有抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、抗心血管疾病、抗感染、提高免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能[4]，因此被廣泛應(yīng)用于保健食品、醫(yī)藥及化妝品等行業(yè)。目前，角鯊烯含量的測(cè)定方法主要有氣相色譜法(GC)[5-6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[7-8]、高效液相色譜法(HPLC)[9-10]以及超高效液相色譜法(UPLC)[11-12]。由于角鯊烯的極性較小，易溶解于非極性溶劑中，故檢出限均高于氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用色譜法而很少被應(yīng)用于分析檢測(cè)中。氣相色譜法測(cè)定中大多數(shù)采用有機(jī)溶劑溶解直接進(jìn)樣，不僅污染了色譜柱，還縮短了色譜柱的使用壽命。由于角鯊烯是一種脂質(zhì)不皂化物，因此可對(duì)樣品進(jìn)行皂化前處理，然后萃取凈化皂化液，從而可脫除樣品中較多的雜質(zhì)峰。筆者建立了氣相色譜法測(cè)定蟬花中角鯊烯的色譜條件，并對(duì)不同部位天然蟬花的角鯊烯含量進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑。蟬花(CordycepscicadaeShing)產(chǎn)自江蘇省句容市磨盤山；角鯊烯對(duì)照品(含量99.5%)，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)140721-200601；正己烷為色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備。Agilent 7890A-FID氣相色譜儀，MD 200氮?dú)獯祾邇x，梅特勒-托利多ME204E 電子天平，艾本森MixPuls渦旋混合儀，KH5200型超聲波清洗器，DJ-04B型粉碎機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備。精密稱取角鯊烯對(duì)照品適量，置50 mL容量瓶中，加正己烷溶解稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為214.30 mg/mL的對(duì)照儲(chǔ)備液。

1.2.2 供試溶液的制備。精密稱定烘干至恒重的樣品粉末約1 g，置于50 mL離心管中，加正己烷20 mL，在40 kHz、200 W條件下超聲提取30 min，冷卻后過(guò)濾，將濾液用氮?dú)獯蹈?。在吹干的蟬花脂肪酸中加入0.5 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液 1.0 mL，搖勻，40 ℃水浴加熱5 min，取出冷卻，加入正己烷2.0 mL萃取，靜置 10 min，取上清液，過(guò) 0.22 μm濾膜，作為供試溶液，備用。

1.2.3 氣相色譜條件。采用Agilent HP-5毛細(xì)管色譜柱(30.00 m × 0.32 mm × 0.25 μm，Agilent Technologies)，載氣為氮?dú)?純度 99.999%)；空氣流速400 mL/min，氫氣流速30 mL/min，氮?dú)饬魉? mL/min；檢測(cè)器FID溫度為290 ℃，進(jìn)樣口溫度為280 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，分流比為10∶1；程序升溫：初始溫度180 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化 采用超聲、索氏2種方法進(jìn)行提取，蟬花中角鯊烯質(zhì)量百分含量相當(dāng)，索氏提取法較繁瑣、加熱回流時(shí)間較長(zhǎng)，因此選擇超聲提取。參照 GB/T 22110—2008，采用正己烷作為提取溶劑，對(duì)蟬花(1 g)提取油進(jìn)行甲酯化條件的選優(yōu)，結(jié)果表明，皂化溫度40 ℃，皂化時(shí)間5 min，氫氧化鈉-甲醇濃度0.5 mol/L，加入量1.0 mL為最佳皂化反應(yīng)條件。

2.2 色譜條件的選擇 由于角鯊烯易溶于非極性溶劑，一般采用非極性色譜柱用于角鯊烯的分離和測(cè)定，因此該試驗(yàn)采用非極性色譜柱 HP-5耐高溫低流失毛細(xì)管柱。角鯊烯沸點(diǎn)高、難揮發(fā)，出峰時(shí)間較晚，因此采用180 ℃柱溫作為初始溫度，并在較文獻(xiàn)[9]低的溫度250 ℃下保持10 min，結(jié)果減少了角鯊烯檢測(cè)時(shí)間，色譜峰的分離效果好且基線較平穩(wěn)。在此色譜條件下，角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的色譜圖見圖1。

圖1 角鯊烯對(duì)照品(A)、蟬花(B)的GC色譜Fig.1 Gas chromatography of squalene reference substances (A) and C.cicadae (B)

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 線性關(guān)系考察。分別精密移取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL對(duì)照儲(chǔ)備液，用正己烷定容于2 mL容量瓶中，搖勻，得各濃度對(duì)照品溶液，按“2.2”色譜條件測(cè)定。以角鯊烯質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到回歸方程Y=2.038 9X+4.123 2 (r=0.999 2，n=6)，結(jié)果表明角鯊烯質(zhì)量濃度在21.43～214.30 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn)。取同一對(duì)照品溶液按“1.2.3”色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，計(jì)算峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD為1.15% (n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)。取蟬花粉6份，按“1.2.2”方法制備供試溶液，按“1.2.3”色譜條件測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算角鯊烯的含量，得角鯊烯的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28.00 μg/g，RSD為3.71% (n=6)，結(jié)果表明制備方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一供試溶液按“1.2.3”色譜條件測(cè)定，每隔2 h進(jìn)樣1次，共進(jìn)樣7次，計(jì)算峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD為3.23%(n=7)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 回收率試驗(yàn)。精密稱取同一批蟬花粉樣品約1 g，共9 份，分別精確加入42.86 μg/mL角鯊烯對(duì)照品溶液1.00、1.50、2.00 mL 各 3 份，按“1.2.2”方法制備供試溶液，得出角鯊烯的平均回收率為88.10%(n=9)，結(jié)果見表 1。

表1 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.4 樣品中角鯊烯含量測(cè)定 采用“1.2.2”方法制備供試溶液，按“1.2.3”色譜條件測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算角鯊烯的含量，測(cè)定結(jié)果得出，天然蟬花和蟬花蟲體中角鯊烯含量分別為(26.67±0.57)、(49.61±0.38)μg/g,蟬花子座中未檢出角鯊烯。由此可以看出，蟬花子座中角鯊烯含量極其微少或不存在。天然蟬花復(fù)合體由子座和蟲體2部分構(gòu)成，蟬花蟲體中的角鯊烯含量大于子座，說(shuō)明角鯊烯在天然蟬花中分布是不均勻的。

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)采用的方法測(cè)定天然蟬花中角鯊烯含量為(27.76±0.57) μg/g，與衛(wèi)亞麗等[5]測(cè)定結(jié)果(74.36±0.24)μg/g的差異較大。蟬花角鯊烯含量差異的原因，可能一方面與蟬花的產(chǎn)地有關(guān)，另一方面與角鯊烯的提取方法有關(guān)。具體的提取方法還有待進(jìn)一步研究。

該研究建立了毛細(xì)管氣相色譜測(cè)定蟬花的角鯊烯含量的方法，升溫程序簡(jiǎn)單，樣品分析時(shí)間短，重復(fù)性好，靈敏度高，角鯊烯色譜峰分離效果好，經(jīng)過(guò)不同樣品測(cè)定，定量準(zhǔn)確，故此方法可以用于蟬花中角鯊烯含量的測(cè)定。

[1] 王瓊，王春雷，何福根,等.地方藥材金蟬花的研究進(jìn)展[J].腫瘤學(xué)雜志,2013,19(3):227-230.

[2] 官波,鄭文誠(chéng).功能性脂質(zhì)——角鯊烯提取純化及其應(yīng)用[J].糧油食品科技,2010,18(4):27-30.

[3] NAZIRI E,TSIMIDOU M Z.Formulated squalene for food related applications[J].Recent Pat Food Nutr Agric,2013,5(2):83-104.

[4] 王寶琴，任麗麗.角鯊烯的來(lái)源及其制備方法研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2015,36(21):193-197.

[5] 衛(wèi)亞麗,楊茂發(fā),劉愛英,等.毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定中藥蟬花中角鯊烯的含量[J].藥物分析雜志,2014,34(11):1975-1978.

[6] 王李平,林晨,蔡大川,等.氣相色譜法測(cè)定茶油中角鯊烯的含量[J].食品工業(yè),2015,36(2):284-286.

[7] 汪運(yùn)明,陳華勇,楊繼國(guó),等.氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定茶油中角鯊烯含量[J].食品工業(yè)科技,2011,32(6):404-406.

[8] 石金娥,于海玲,王巖,等.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定南瓜籽油中角鯊烯的含量[J].中國(guó)油脂,2014,39(11):88-91.

[9] 陳偉珠,晉文慧,張怡評(píng),等.角鯊烯的高效液相色譜檢測(cè)法[J].食品研究與開發(fā),2015,36(24):131-134.

[10] 張欣,于瑞祥,楊瑞鈺,等.植物油中角鯊烯的提取與高效液相色譜法分析[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2013,28(5):96-99.

[11] 陳偉珠,方華,張怡評(píng),等.超高效液相色譜法檢測(cè)角鯊烯[J].食品與發(fā)酵科技,2014,50(6):74-77.

[12] 榮維廣,劉華良,李莉,等.超高效液相色譜法測(cè)定保健食品中角鯊烯[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志,2013,29(8):734-736.

Determination of Squalene in Cordyceps cicadae Shing by Gas Chromatography

FAN Jun-min,JIA Jun*,XIE Chun-qin et al

(Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry,Jurong,Jiangsu 212400)

[Objective] To establish a method of capillary gas chromatography to detect the content of squalene inCordycepscicadae.[Method] Squalene inCordycepscicadaeShing was detected by gas chromatography.And the squalene contents in different parts ofC.cicadaewere compared.The optimal condition for the detection of squalene inC.cicadaewas obtained.[Result]C.cicadae(1 g) was extracted by ultrasonic extraction,the product was methyl esterified at 40 ℃ for 5 min by 1 mL of 0.5 mol/L sodium hydroxide-methanol solution and then extracted by n-hexane.The squalene could be determined quantitatively by GC.When the squalene concentration was from 21.43 to 214.30 μg/mL,there was a good linear relation (r=0.999 2) and a perfect method precision (RSD= 3.71%),and the recovery rate was 77.80%-97.32%,and the average recovery rate was 88.10% (n=9).[Conclusion] This method was simple and rapid with low pollution and high sensitivity,and it is suitable for determination of squalene content inC.cicadae.

CordycepscicadaeShing; Squalene; Gas chromatography

江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研基金項(xiàng)目(2015kj034)；創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)科研基金項(xiàng)目(2014td002)。

凡軍民(1977- )，女，湖北荊州人，副教授，博士，從事食品及相關(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)研究。*通訊作者，教授，博士，從事食品檢測(cè)研究。

2016-07-29

TS 201.2

A

0517-6611(2016)28-0094-02