梁遠(yuǎn)園，桂蜀華，倪 晨（廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心，廣州市 510405）

蓮芝消炎片由穿心蓮干浸膏和山芝麻干浸膏組成，具有抗菌消炎、清熱解毒、涼血消腫作用[1，2]。臨床上用于治療肺胃有熱、火毒內(nèi)盛引起的咳嗽氣喘、痄腮、乳蛾、喉痹咽痛。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中所采用的方法煩瑣，故筆者采用薄層色譜（TLC）法對(duì)蓮芝消炎片中穿心蓮、山芝麻進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)蓮芝消炎片中脫水穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)行含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

SUMMIT HPLC儀，包括P580Pump、ASI-100自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器（德國(guó)戴安公司）；萬分之一電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KQDE3200醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（功率：150 W，頻率：40 kHz，江蘇昆山超聲設(shè)備廠）；電子數(shù)控式恒溫水浴鍋（北京醫(yī)療設(shè)備廠）。

蓮芝消炎片（廣州采芝林藥業(yè)有限公司，批號(hào)：試001、試002、試003）；各鑒別項(xiàng)陰性樣品均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心提供；硅膠G、GF254薄層板（青島海洋化工廠，規(guī)格：100×100 mm）；脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)：110854-200305）、山芝麻對(duì)照藥材（批號(hào)：121088-200702）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 穿心蓮的TLC鑒別[3，4]

取本品10片，除去包衣，研細(xì)，稱取2 g，加乙醇40 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?0 mL乙醇溶解，作為供試品溶液；取缺穿心蓮的陰性樣品適量，同法制成陰性對(duì)照溶液；另取脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品，加甲醇制備成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC法[5]試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液5 μL，對(duì)照品和陰性對(duì)照溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（4∶3∶0.4）為展開劑，展開至8 cm，取出，晾干，在紫外光燈（254 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。穿心蓮的TLC見圖1。

圖1 穿心蓮的TLC1～3.供試品；4.脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品；5.陰性對(duì)照Fig 1 TLC of Andrograpnis paniculata 1～3.test samples；4.dehydroandrographolide control；5.negative control

2.2 山芝麻的TLC鑒別[6，7]

取本品，去糖衣，研細(xì)，稱取粉末3 g，加甲醇30 mL回流提取30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?0%氫氧化鉀溶液30 mL，回流提取30 min，放冷，用濃鹽酸調(diào)pH至4～5，用氯仿萃取2次，每次30 mL，合并氯仿液，蒸干，加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液；取缺山芝麻的陰性樣品適量，同法制成陰性對(duì)照溶液；另取山芝麻對(duì)照藥材0.5 g，加60%乙醇回流提取3次，每次1 h，過濾，合并過濾液，蒸干，加水10 mL，加乙酸乙酯5 mL萃取，分取乙酸乙酯層，濃縮至1 mL，作為對(duì)照藥材溶液。照TLC法[5]試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液5 μL，對(duì)照藥材和陰性對(duì)照溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸（7∶0.5∶1）為展開劑，展開8 cm，取出，晾干，在紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。山芝麻的TLC見圖2。

圖2 山芝麻的TLC1～3.供試品；4.山芝麻對(duì)照藥材；5.陰性對(duì)照Fig 2 TLC of Radix helicteris 1～3.test samples；4.R.helicteris control；5.negative control

2.3 脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品5.0 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇適量溶解，加甲醇至刻度，搖勻，制成每1 mL含脫水穿心蓮內(nèi)酯0.50 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備取本品20片，研細(xì)，本品粉末置于五氧化二磷為干燥劑的干燥器內(nèi)干燥48 h以上，取本品粉末（過四號(hào)篩）約0.20 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，用60%乙醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 色譜條件色譜柱：Phenomenex luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（60∶40）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm。理論板數(shù)按脫水穿心蓮內(nèi)酯峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000，方中其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。色譜見圖3。

圖3 高效液相色譜圖A.供試品；B.脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品；C.陰性對(duì)照Fig 3 HPLC chromatogramsA.test samples；B.dehydroandrographolide control；C.negative control

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液2、4、6、8、10 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝26.449 4X－1.418 9（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，脫水穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)樣量在0.516～5.16 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，在上述色譜條件下依法測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，RSD＝1.02%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液適量，分別在放置0、2、4、8、10 h時(shí)，在上述色譜條件下各進(jìn)樣5 μL，依法測(cè)定。結(jié)果，RSD＝1.43%（n＝6），表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 用同一批樣品適量（批號(hào)：試003），按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)平行操作6份，在上述色譜條件下依法測(cè)定。結(jié)果，脫水穿心蓮內(nèi)酯的平均含量為10.45 mg·g-1，RSD＝1.70%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定6份已知含量的樣品（含量：20 mg·g-1），每份0.20 g，分別加入2 mg脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下依法測(cè)定含量，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均回收率為98.46%，RSD＝0.89%（n＝6）。

2.3.9 樣品含量測(cè)定 取3批樣品（批號(hào)：試001、試002、試003），按上述方法進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果，3批樣品中每片含脫水穿心蓮內(nèi)酯分別為2.14、2.13、2.09 mg，RSD分別為1.80%、0.96%、1.30%，n均為3，表明樣品中脫水穿心蓮內(nèi)酯含量在2.09 mg/片～2.14 mg/片之間，建議成品每片含穿心蓮以脫水穿心蓮內(nèi)酯（C20H28O4）計(jì)不得低于2.00 mg。

3 討論

在提取溶媒選擇的試驗(yàn)中，筆者分別考察用無水乙醇、60%乙醇、甲醇3種溶劑提取樣品，從結(jié)果來看，60%乙醇提取得到的脫水穿心蓮內(nèi)酯最多，提取最完全，因此提取溶媒選用60%乙醇。在考察提取方法試驗(yàn)中，筆者分別采用了超聲提取、回流提取。結(jié)果，超聲提取30 min的提取最完全，而且方法操作簡(jiǎn)單，故選用超聲提取30 min。

綜上，所建質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可用于蓮芝消炎片的質(zhì)量控制。

[1] 鄭虎占，董澤紅.中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用（第4卷）[M].北京：學(xué)苑出版社，1990：3 943.

[2] 孫璐璐，張石革.五官科用藥（四）－咽喉用藥[J].中國(guó)藥房，2003，14（1）：59.

[3] 程本利.高效液相法測(cè)定穿心蓮膠囊中脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[J].安徽醫(yī)藥，2005，9（8）：257.

[4] 朱至明.幾種中成藥中脫水穿心蓮內(nèi)酯的薄層色譜鑒別[J].中藥材，2002，25（9）：634.

[5] 國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄34.

[6] 文東旭.山芝麻的薄層色譜鑒別研究[J].廣西醫(yī)藥，2003，25（12）：2 434.

[7] 郭新東.中藥山芝麻的化學(xué)成分研究（I）[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，42（2）：52.