邵曉瑋，楊曉瑩，師亞玲，王嗣岑，盧 聞

(西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061)

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·藥劑·

紅毛新堿固體分散體的制備及大鼠在體腸吸收研究

邵曉瑋，楊曉瑩，師亞玲，王嗣岑，盧 聞*

(西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061)

目的 采用固體分散體技術(shù)改善紅毛新堿的溶解度，增加其胃腸道吸收。方法 以聚乙烯吡咯烷酮為載體，正交實驗設(shè)計優(yōu)化紅毛新堿固體分散體制備工藝；大鼠在體單向腸灌流法考察腸道吸收情況。結(jié)果 紅毛新堿固體分散體的制備工藝為：紅毛新堿和載體質(zhì)量比為1∶12；溶劑用量比為4∶3；溶劑蒸發(fā)溫度為65 ℃；冷凍時間為4h；制備工藝優(yōu)化的固體分散體平衡溶解度為690.2±9.8μg·mL-1，比紅毛新堿提高了33倍，1h累積溶出百分率達(dá)94 %，比紅毛新堿提高近5倍；且固體分散體顯著提高了相同質(zhì)量濃度紅毛新堿的在體腸吸收速率常數(shù)和表觀吸收系數(shù)(P<0.05)。結(jié)論 固體分散體技術(shù)提高了紅毛新堿的溶解度和溶出速率，增加了其腸道吸收。

紅毛新堿；固體分散體；溶出度；在體單向腸灌流法

陜西七藥是我國豐富草藥資源的一部分，紅毛七(Caulophyllum robustumMaxim)[1]作為陜西七藥的一種，主要含有生物堿和三萜皂苷等多種成分[2]。紅毛七來源于小檗科牡丹草屬植物類葉牡丹的根莖及根。民間用于治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕等多種疾病，具有很高的開發(fā)價值[3]。紅毛新堿是利用細(xì)胞膜色譜技術(shù)從紅毛七中分離得到的一類新的生物堿類化合物[4]。藥理研究表明，紅毛新堿具有抗心肌缺血的活性，但其具有溶解度低、腸道吸收差和生物利用度低等缺點[5]。因此，改善紅毛新堿溶解度、增加體內(nèi)吸收是進一步明確紅毛新堿藥理作用的關(guān)鍵步驟。

本文以PVPK30為載體、以平衡溶解度為指標(biāo)，通過正交實驗設(shè)計，優(yōu)化了紅毛新堿固體分散體的制備工藝，考察了紅毛新堿及其固體分散體的體外溶出度和大鼠在體腸吸收情況。

1 儀器與材料

1.1 儀器 2010AHT型高效液相色譜儀(日本島津公司)；RC-8D溶出度測試儀(天津市國銘醫(yī)藥設(shè)備有限公司)；BT1-100恒流泵(上海琪特分析儀器有限公司)。

1.2 試藥 紅毛新堿(實驗室自制，HPLC檢測質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)；PVPK30(博愛新開源制藥有限公司)；甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；其他試劑均為分析純。

1.3 動物 健康SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200±20g，由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供，SCXK(陜)2012-003。

2 方法與結(jié)果

2.1 固體分散體制備 采用溶劑法制備紅毛新堿固體分散體，按照紅毛新堿和PVPK30質(zhì)量比1∶3，1∶6，1∶9，1∶12和1∶15分別稱取樣品，加入適量無水乙醇溶解，置于水浴中加熱，攪拌至溶劑揮發(fā)完全，迅速移至-18 ℃冰箱中冷凍，定時取出，減壓干燥，粉碎，得固體分散體。另按照比例稱定紅毛新堿和PVPK30，混勻，過篩，得紅毛新堿和載體的物理混合物，備用。

為確定制備工藝參數(shù)，采用正交實驗設(shè)計L9(34)對無水乙醇用量比(無水乙醇體積∶藥物與載體總質(zhì)量和)、溶劑蒸發(fā)溫度和冷凍時間3個因素進行考察，因素水平見表1。

表1 正交實驗因素與水平

Tab.1Factorsandlevelsoftheorthogonaltest

水平A,無水乙醇用量比B,溶劑蒸發(fā)溫度/℃C,冷凍時間/h12/355221/165434/3756

以平衡溶解度為指標(biāo)，考察PVPK30不同用量對紅毛新堿溶解度的改善情況。隨載體比例增加，紅毛新堿溶解度逐漸增大，測得平衡溶解度分別為：300.0，345.6，425.4，511.8和513.4μg·mL-1。當(dāng)載體比例為1∶15，紅毛新堿溶解度增加程度明顯減小，已接近PVPK30增溶容量。綜合考慮增溶效果和載體用量，后續(xù)研究選擇紅毛新堿和PVPK30質(zhì)量比為1∶12制備固體分散體。

同樣以平衡溶解度為評價指標(biāo)，采用正交實驗設(shè)計優(yōu)化了溶劑法制備固體分散體的工藝參數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 正交實驗結(jié)果

Tab.2 Results of the orthogonal test(n=3)

正交實驗直觀分析表明，考察因素對平衡溶解度的影響順序為B>A>C，最佳制備工藝為A3B2C2，即無水乙醇用量比為4/3，溶劑蒸發(fā)溫度為65 ℃，冷凍時間為4h。以優(yōu)化工藝制得紅毛新堿-PVPK30固體分散體的平衡溶解度為690.2±9.8μg·mL-1，比紅毛新堿溶解度提高了近33倍。

2.2 體外溶出度測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：DiamonsilC18(150mm×4.6mm, 5μm)；流動相：甲醇-5mL·L-1甲酸溶液(35∶65)；流速：1.0mL·min-1；檢測波長：267nm；柱溫：25 ℃。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取紅毛新堿約10mg，精密稱定，置于25mL量瓶中，加適量甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度為400.0μg·mL-1的儲備液。精密量取儲備液適量，用流動相配制成質(zhì)量濃度為100.0，50.0，10.0，1.0和0.5μg·mL-1的系列對照品溶液，進行HPLC測定。以紅毛新堿質(zhì)量濃度(X)對峰面積(Y)進行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=128 833 X-2 124.2，r=0.999 9；日內(nèi)、日間精密度均小于1.2%，準(zhǔn)確度為98.8%～99.2%。

2.2.3 溶出度測定 采用《中國藥典》2010年版[6]及文獻[7]溶出度測定法，以蒸餾水200mL作為溶出介質(zhì)，溫度為37±0.5 ℃，轉(zhuǎn)速為100r·min-1。將紅毛新堿、紅毛新堿與PVPK30的物理混合物和紅毛新堿固體分散體粉末(相當(dāng)于15mg紅毛新堿)均勻灑在液面上，分別于1，5，10，15，20，25，30，40，50和60min取樣0.5mL，同時補充同溫度的新鮮溶出介質(zhì)0.5mL。樣品經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液10μL進行HPLC測定，以累積溶出百分率對時間作圖，繪制溶出曲線，見圖1。

圖1 紅毛新堿及其固體分散體體外溶出曲線

Fig.1Cumulativedissolutionrateofcaulophineanditssoliddispersion

結(jié)果表明，紅毛新堿溶出較慢，1h的累積溶出百分率僅為19.5 %；物理混合物和固體分散體都能提高紅毛新堿的溶出速率，其中物理混合物1h的累積溶出百分率達(dá)31%，固體分散體1h的累積溶出百分率達(dá)94%，明顯高于物理混合物的溶出度。

2.3 大鼠在體腸吸收

2.3.1 色譜條件 色譜柱：DiamonsilC18(150mm×4.6mm,5μm)；流動相：甲醇-5mL·L-1甲酸溶液(35∶65)；流速：1.0mL·min-1；檢測波長：267nm；柱溫：25 ℃。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取紅毛新堿儲備液，精密量取適量，用Krebs-Ringer(K-R)營養(yǎng)液配制系列對照品溶液，進行HPLC測定。以紅毛新堿質(zhì)量濃度(X)對峰面積(Y)進行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=146 129X-1 089.3；r=0.999 9；日內(nèi)、日間精密度均小于1.7%，準(zhǔn)確度在98.4%～99.1%。

2.3.3 紅毛新堿在K-R營養(yǎng)液中穩(wěn)定性考察 以經(jīng)腸灌流后的K-R營養(yǎng)液配制成質(zhì)量濃度為10.0μg·mL-1的紅毛新堿供試溶液，置于37±0.5 ℃的恒溫振蕩器中，定時取樣，進行HPLC測定?；厥章蕿?8.3%～102.5%，表明紅毛新堿在經(jīng)腸灌流液中8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 大鼠單向腸灌流 參照文獻方法[8-9]，向?qū)嶒炃?2h禁食的健康雄性大鼠腹腔注射200g·L-1的烏拉坦溶液0.65mL·kg-1。麻醉后，大鼠背位固定，沿腹中線切開腹腔，分離空腸，兩端插管并結(jié)扎，用37 ℃生理鹽水沖凈腸道內(nèi)容物，裝好回流裝置。先以K-R營養(yǎng)液回流15min平衡腸道，后將紅毛新堿供試液以1mL·min-1的流速灌流腸段20min，再以0.2mL·min-1的流速灌流45min，達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。在回流15，30，45，60和75min時取樣，用HPLC法分析測定樣品中的紅毛新堿質(zhì)量濃度，實驗中采用重量法校正供試藥液流經(jīng)腸段后因體積變化而導(dǎo)致的質(zhì)量濃度偏差。按照下式計算試藥吸收速率常數(shù)(Ka)和表觀吸收系數(shù)(Papp)：

Ka=(1-CoutQout/CinQin)Q/V

Papp=-Qln(CoutQout/CinQin)/2πr2L

Qin和Qout分別為灌入和收集的供試液體積(mL)(經(jīng)過密度校正)；Cin和Cout分別為腸段進口處和出口處灌流液的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)；L為灌流腸段長度(cm)；r為灌流腸段橫截面半徑(cm)；Q為灌流速度(0.2mL·min-1)；V為灌流腸段的體積，可按照πr2L計算。不同紅毛新堿供試液腸吸收情況見表3。

因紅毛新堿溶解度的限制，在37 ℃、K-R營養(yǎng)液中，低、中、高質(zhì)量濃度紅毛新堿供試液的配制質(zhì)量濃度分別為1，5和15μg·mL-1；而固體分散體較好地改善了其溶解度，故紅毛新堿固體分散體供試液的配制質(zhì)量濃度分別為15，50 和150μg·mL-1。

對不同紅毛新堿供試液空腸段吸收速率常數(shù)和表觀吸收系數(shù)進行方差分析表明，低、中、高質(zhì)量濃度紅毛新堿供試液的Ka和Papp值之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；相同質(zhì)量濃度的紅毛新堿供試液和固體分散體供試液的Ka和Papp值之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；低、中質(zhì)量濃度紅毛新堿固體分散體供試液的Ka和Papp值之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而低、中質(zhì)量濃度固體分散體供試液與高質(zhì)量濃度固體分散體供試液的Ka和Papp值之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由結(jié)果可知，溶解度是影響紅毛新堿腸道吸收的主要因素，當(dāng)固體分散體提高紅毛新堿的溶解度由15μg·mL-1增加到50μg·mL-1時，其腸道吸收程度增大，同時，相同質(zhì)量濃度的固體分散體較紅毛新堿的吸收系數(shù)明顯提高，說明固體分散體增加了紅毛新堿在腸液中的潤濕性，而利于被小腸吸收。

表3 紅毛新堿供試液空腸段吸收速率常數(shù)和表觀吸收系數(shù)

Tab.3 The absorption rate constant and apparent absorption coefficient of caulophine in jejunum(n=3)

注：與15μg·mL-1紅毛新堿供試液的吸收速率常數(shù)和表觀吸收系數(shù)比較，aP<0.05；與150μg·mL-1紅毛新堿固體分散體供試液的吸收速率常數(shù)和表觀吸收系數(shù)比較，bP<0.05。

3 討論

紅毛新堿固體分散體制備預(yù)實驗中，考察了其他載體材料[10]，如PEG6 000，PEG4 000及Poloxamer188，紅毛新堿溶解度只提高了3～4.5倍，而PVPK30作為載體制備的紅毛新堿固體分散體的平衡溶解度約提高了33倍。因此，實驗選擇PVPK30作為載體。

實驗采用一定質(zhì)量濃度的紅毛新堿供試液在大鼠的十二指腸、空腸和回腸處分別進行了腸吸收實驗，其Ka×10-2值分別為1.26±0.08，1.27±0.12，1.28±0.12；Papp×10-3值分別為1.12±0.08，1.15±0.12和1.14±0.11。方差分析表明，紅毛新堿在十二指腸、空腸和回腸的Ka、Papp值之間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，因此實驗選用了空腸段進行腸吸收實驗。

在體腸吸收實驗普遍存在的問題是藥液的體積會因腸道吸收或分泌水分而發(fā)生變化，從而影響藥物的質(zhì)量濃度，因此需要對藥物質(zhì)量濃度進行校正。藥液質(zhì)量濃度的校正方法有酚紅法和重量法，由于在酚紅的最大吸收波長處存在紅毛新堿背景干擾，因此，本文選擇了重量法來校正紅毛新堿的質(zhì)量濃度。

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Preparation of caulophine solid dispersion and study on the intestinal absorption in rats

SHAOXiaowei,YANGXiaoying,SHIYaling，WANGSicen,LUWen*

(SchoolofPharmacy,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an710061，China)

ObjectiveToimprovethesolubilityandintestinalabsorptionofcaulophinebysoliddispertiontechnique.MethodCaulophinesoliddispersionwaspreparedwithPVPK30ascarriers.Orthogonaldesignwasappliedtooptimizethesoliddispersionpreparationprocedure.Intestinalabsorptionofcaulophineanditssoliddispersionwereevaluatedbyanin situsingle-passintestinalperfusioninrats.ResultTheoptimizedpreparationprocedureofcaulophinesoliddispersionwasconfirmed,thatis,themassratioofcaulophineandPVPK30 1∶12,theratioofsolventvolumeandsample4∶3,theevaporatingtemperature65 ℃,andthecoolingtime4h.Theequilibriumsolubilityofsoliddispersionpreparedbyoptimizedtechnologywas690.2±9.8μg·mL-1, 33timeshigherthanthatofcaulophine.Thepercentageofaccumulativedissolutionofcaulophinesoliddispersionwas94%in1h, 5timeshigherthanthatofcaulophine.Theabsorptionrateconstantandapparentabsorptioncoefficientsofthesoliddispersionweremuchhigherthanthoseofcaulophinewiththesameconcentrationinsingle-passintestinalperfusion(P<0.05).ConclusionThetechniqueofsoliddispersionsignificantlyimprovedthesolubilityanddissolutionrateofcaulophine,anditsintestinalabsorptioninrats.

caulophine;soliddispersion;dissolution;singlepassintestinalperfusion

“十二五”國家“重大新藥創(chuàng)制”專項(編號：2012ZX09103201-054)

邵曉瑋，女，碩士研究生

*通信作者：盧聞，女，副教授，碩士生導(dǎo)師

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.016

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2016-01-11)