劉 巍，李培森，李 可，武 鑫

（1.天津工業(yè)大學省部共建分離膜與膜過程國家重點實驗室，天津 300387；2.天津工業(yè)大學環(huán)境與化學工程學院，天津 300387）

人工細胞制備的研究進展

劉 巍1，2，李培森1，2，李 可2，武 鑫2

（1.天津工業(yè)大學省部共建分離膜與膜過程國家重點實驗室，天津 300387；2.天津工業(yè)大學環(huán)境與化學工程學院，天津 300387）

人工細胞即是模擬細胞精巧結構制備出與生物細胞功能相近的細胞微囊，如將一些生物大分子包埋在其中用以實現(xiàn)特定功能或尋找新型材料制備具有良好通透性細胞膜的人工細胞等.從人工細胞化學法和生物法制備的角度對近幾十年來人工細胞的發(fā)展以及應用進行簡要概述，并探討了目前人工細胞發(fā)展面臨的困難和未來研究的方向.

人工細胞；制備方法；微囊；固定化酶；多酶固定化；載體

生命體內的細胞因功能不同而分化為多種細胞，各種生物大分子的協(xié)同作用使得細胞的各種功能得以順利進行.科學家通過研究各種細胞的優(yōu)勢功能，模擬其精巧結構合成人工細胞，不僅進一步了解了生命體的本質，同時也發(fā)明出相應的智能材料，促進了各領域的技術進步.

1964年加拿大McGill大學Chang［1］首次提出了人工細胞的概念，即用具有生物相容性的半透膜包裹組織細胞，該半透膜僅允許小分子的營養(yǎng)物質、代謝產(chǎn)物和分泌物通過，而阻止大分子物質包括免疫活性細胞和抗體通過.20世紀80年代初期，加拿大多倫多大學的Lim和Sun［2］成功制成了能夠包裹胰島細胞的海藻酸鈉-聚賴氨酸-聚乙烯亞胺膜，并將其植入到患有糖尿病的實驗鼠體內，實驗鼠維持了3周的正常血糖，但最終由于聚乙烯亞胺會引發(fā)炎癥而導致實驗失敗. 1986年，O′Shea等［3］用海藻酸鈉代替聚乙烯亞胺，制成了海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉膜，這種膜具有較好的生物相容性，成功地構建了較為理想的人工細胞.

目前的人工細胞大多是以雙親聚合物為細胞膜，這種膜在選擇透過性和穩(wěn)定性上都存在問題，為了改善這個問題，人工細胞上往往需要復雜的通道蛋白和離子泵來調節(jié)細胞和外界環(huán)境的物質交換.Mansy等［4］證明了這種細胞膜能使膜外的活性核苷酸自發(fā)地穿過細胞膜參與信息復制.

東京大學的Kurihara等［5］研制出了一種可以實現(xiàn)DNA擴增（PCR）、能自我復制的人工細胞.南開大學史林啟課題組［6］將醇氧化酶和過氧化氫酶的酶納米復合物進行包埋，制備出一種能夠降解血液中酒精含量的人工細胞.除了直接在細胞中包埋生物大分子或改善細胞膜用以合成具有某一特定功能的人工細胞外，各界學者在人工細胞的制備方法上也不斷推陳出新，使人工細胞可以實現(xiàn)分區(qū).

層層自組裝法（LbL）可以制備得到力學、熱學相對穩(wěn)定的微囊結構［7-8］.利用LbL法制備出不同粒徑且大小均一的細胞微囊，還可以控制囊壁的機械強度和通透性.目前應用最多的是靜電層層自組裝，它是利用聚合物陰陽離子間的靜電作用力來制備細胞微囊，最后在去除核之后的中空結構中包埋酶分子，可使酶分子保持生物活性［9］.利用LbL法制備有機/無機雜化的細胞微囊在多酶固定化研究和藥物傳遞中將具有很強的指導意義.

目前，人工細胞作為一種組織工程、藥物負載及催化化學領域的新興技術已成為科學家們研究的熱點.本文將從制備的角度對人工細胞的發(fā)展現(xiàn)狀進行綜述.

1 人工細胞制備方法的分類

人工細胞制備方法一般可分為2類：一類是利用生物方法構建自然界中本不存在的所謂的minimal cell［10］，它是一種自上而下的方法［11-12］，即移除自然界中生物真實生命體細胞的一些不必要的基因、細胞器等，直至得到可以存活的最小單元［12-13］；另一類則是利用化學方法合成的，稱為synthetic cell、artificial cell、primitive cells、organelle、protocell等［4-5，14-19］，它是一種自下而上的方法，即利用化學方法將基本的化學分子組裝起來獲得具有一定功能的模擬細胞的微囊［4，12，19］.

生物法合成人工細胞一般是生物學家常用的方法，他們不斷尋找能夠維持細胞生存、復制的最小基因組，將該最小基因組轉入另一個細胞后可使另一個細胞的種類完全發(fā)生改變.如生殖支原體由于其代謝量小、基因組冗余少且是可以在純培養(yǎng)物中生長的最小基因組，被認為是能夠維持細菌生存的最小單元.使用全局轉位子誘變，從482個生殖支原體蛋白編碼基因中去除100非必需基因后，將剩余的由382個生殖支原體蛋白編碼基因，3個磷酸鹽轉運蛋白基因和43個RNA編碼基因構成最小基因組轉入另一種細胞體內，另一種細胞表現(xiàn)出了生殖支原體的特性［11］.

將一種細菌細胞中的全基因組移植入另一物種的基因組中，通過合成基因組的繁殖，可使子代細胞的物種發(fā)生改變.如Carole等［12］以四環(huán)素抗性細胞完整的基因組作為供體，由絲狀支原體LC染色體攜帶，利用聚乙二醇介導法將其移植到山羊支原體細胞中，合成基因組繁殖后，子代細胞的性狀與絲狀支原體LC供體菌株幾乎相同.

化學法合成人工細胞的材料通常有脂質體、雙親聚合物等，合成方法一般有層層自組裝法、溶膠-凝膠法、乳液法等.目前人們制備的大多數(shù)人工細胞都是基于如DNA和RNA這樣復雜的天然分子，但對于人工細胞同生物之間的信息交流的研究卻很少.Grardner等［14］利用簡單的原料合成復雜的碳水化合物，該碳水化合物可以構建一種脂質結合體（protometabolism）.這種糖類能夠引起海洋菌Vibrio harveyi的群體效應，產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，實現(xiàn)了人工細胞與生物之間的信息傳遞.如圖1所示，脂質體（L）囊泡（頂部）內發(fā)生自催化甲醛聚糖反應.囊泡外pH升高啟動碳水化合物的合成.形成的碳水化合物-硼酸鹽復合物（右上）通過媒介與Vibrio harveyi（右下）相互作用，成功與Vibrio harveyi發(fā)出的的信號結合，產(chǎn)生熒光蛋白（左下角）.

圖1 人工細胞的代謝產(chǎn)物引起海洋菌Vibrio harveyi的群體效應Fig.1 Metabolic products are capable of engaging natural quorum sensing mechanism of marine bacterium Vibrio harveyi

目前，在生物醫(yī)學領域已有大量文獻報道了生物法合成人工細胞的發(fā)展現(xiàn)狀，本文不再贅述，僅從化學法的角度對人工細胞作出闡述.化學法合成人工細胞容易制得具有特異性功能的細胞微囊且發(fā)揮性能較穩(wěn)定，所以在目前的研究中很受重視.本文將主要從制備原料和制備方法兩個方面介紹化學法合成人工細胞.

2 人工細胞的制備原料

制備人工細胞的材料決定了細胞的性能和應用.如磷脂雙層膜由于是生命體細胞膜的主要組成成分最先引起人們的重視［20-21］，但是這種膜極易被破壞，所以在實際應用中很少使用.在人工細胞中包埋酶時，人工細胞材料的開發(fā)和酶的包埋方法已然成為研究重點，找到一種性能優(yōu)良、價格合理的材料用于包埋酶分子，不僅可以大大提高酶的利用率，同時也使得人工細胞大規(guī)模應用到實際生產(chǎn)中成為可能.因此，在制備人工細胞時一般都要求材料應具有良好的滲透性、生物相容性、一定的機械強度和穩(wěn)定性.目前常被用來合成人工細胞的材料有天然高分子材料和人工合成材料兩大類.

2.1 天然高分子材料

常見的天然高分子材料有殼聚糖及其衍生物類、葡聚糖類、纖維素類、脂質體等.

2.1.1 殼聚糖

殼聚糖又被稱為脫乙酰幾丁質，它是由N—乙酰糖胺和糖胺組成的多聚體，主要通過甲殼素脫乙?；苽?它是自然界中存在的唯一一種帶正電的堿性多糖類物質，廉價易得且制備簡單，經(jīng)改性后衍生物具有機械性能良好、生物相容性好、耐熱、耐酸堿、化學性能穩(wěn)定等優(yōu)點.由于殼聚糖分子鏈上有大量的伯氨基，海藻酸鈉的分子鏈上有大量的羧基，二者可以通正、負電荷吸引形成聚電解質膜，具有較好的成膜特性［22］，所以它是代替多聚賴氨酸制備細胞微囊的理想材料［23］.

用殼聚糖制備人工細胞微囊應用最為廣泛的是在其中固定酶分子.目前，利用殼聚糖為材料的微囊已成功地固定了脂肪酶、α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、牛胰蛋白酶等一百多種酶.如李紅等［24］用醋酸、殼聚糖溶液、戊二酸溶液制成殼聚糖細胞微囊，經(jīng)干燥后用磷酸緩沖液浸泡抽干，加入木瓜蛋白酶攪拌后，然后滴入戊二醛溶液進行交聯(lián)反應，從而得到包埋木瓜蛋白酶的人工細胞.陳金日等［25］利用離子凝膠化原理在磁力攪拌下將三聚磷酸鈉溶液緩慢加入到殼聚糖醋酸溶液中，而后再將α-淀粉酶滴加到混合液中，在室溫下進行吸附15 min后得到包埋α-淀粉酶的人工細胞.

2.1.2 葡聚糖

葡聚糖也常常被用作制備人工細胞的材料.近年來，各種葡聚糖改性載體材料也層出不窮.如陳秀琳等［26］用CM-葡聚糖凝膠作為細胞微囊并向其中固定脂肪酶：先將載體分別用鹽酸和NaOH反復浸泡沖洗至中性后，再用緩沖液平衡，取其上清液，加入脂肪酶溶液進行反應，真空干燥后制得包含有脂肪酶的人工細胞.這種方法得到的人工細胞微囊對脂肪酶具有良好的保護作用，使脂肪酶在耐熱、耐堿和熱穩(wěn)定性上都有了明顯的改善.曹國民等［27］用“油包水”反相懸浮聚合法，將烯丙基葡聚糖與N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺聚合交聯(lián)，直接包埋脂肪酶，獲得的固定化脂肪酶具有較高活性.

2.1.3 脂質體

近年來，脂質體因其主要由卵磷脂、生育酚等天然成分構成，對生物體無毒無害而備受人們關注.脂質體是制備人工細胞的良好材料，脂質體微囊比其他材料微囊小，且細胞微囊對酶的包容量大，從而使人工細胞可以更好地發(fā)揮作用.如Picon A等［28］用脂質體微囊包埋洋薊酶制備得到人工細胞，將其用于生產(chǎn)奶酪，可加速奶酪的形成，大大縮短熟化時間，制成的奶酪與對照實驗并無明顯區(qū)別.

2.2 人工合成材料

無機類吸附材料一般都有穩(wěn)定性好、對生物體無毒無害、機械強度高、成本低廉等優(yōu)點，常用的無機吸附劑有硅藻土、硅凝膠、玻璃、高嶺土、氧化鋁、二氧化鈦等.有研究顯示［29］，無機類吸附材料在作為人工細胞合成原料包埋酶時，包埋酶的量、酶在細胞中的牢固程度以及包埋成功后酶的活性等取決于材料本身的特性.例如，用純二氧化硅包埋α-淀粉酶形成的人工細胞要比氧化硅、硅藻土等材料與酶結合的更加牢固，且細胞中酶的活性更高，在連續(xù)使用一段時間后酶仍然保持著較高的活性.

2.2.2 有機類合成高分子材料

人工合成的高分子材料具有抗機械強度大、抗微生物性能良好、價格便宜等優(yōu)點，所以在合成人工細胞的材料的研究中一直倍受青睞.

（1）海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉.目前，應用最早且技術最為成熟的微囊是海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微囊.海藻酸鈉是一種從褐藻中提取的水溶性聚醛酸鹽，也是聚陰離子聚合物，其中的主要成分是1-4-β-D-甘露糖醛酸和α-L-古羅糖醛酸［30］.研究表明，海藻酸鈉對細胞具有無毒、生物相容性好且免疫原性低等優(yōu)點.聚賴氨酸作為一種聚陽離子聚合物，具有良好的成膜特性，但是，由于其生產(chǎn)工藝復雜，主要依賴進口，故而價格昂貴.對海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微囊進行改善，使其優(yōu)點更加突出，如Sun等［31］在海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微囊內部添加一層纖維蛋白的網(wǎng)狀結構后，能夠明顯改善細胞微囊的生物相容性及穩(wěn)定性，如圖2所示.

（2）無機烷化物前體.用無機烷化物前體制備細胞微囊不僅可以封裝對熱敏感且比較脆弱的生物分子（如酶，蛋白質，抗體和全細胞植物，動物以及微生物），而且它還具有較好的生物相容性、化學惰性、物理剛性、熱穩(wěn)定性.這種細胞微囊通常是用溶膠—凝膠法來制備的.如在制備二氧化硅基質時，溶膠—凝膠過程一般包括醇鹽前體的水解，羥基化單元的縮合、縮聚反應形成多孔凝膠.通常由烷化物正硅酸甲酯、TEOS或TMOS水解啟動在活性生物分子的存在下進行的.Si單體在酸性催化劑下引發(fā)水解和縮合的交聯(lián)反應熟化干燥后形成無定形SiO2基體，它是圍繞生物分子形成的一種立體多孔無機基體，具體制備過程如圖3所示.這種基體可以應用于醫(yī)療，環(huán)境和工業(yè)領域.目前，用溶膠—凝膠法制備的基體封裝細胞器制成的人工細胞已經(jīng)移植到生命系統(tǒng)中，用于實現(xiàn)植物/動物/微生物細胞重要代謝產(chǎn)物的商業(yè)化生產(chǎn)［32］.但是，用這種材料制備的微囊在應用中有一個缺點，那就是容易形成裂痕［32-33］.

圖2 微囊中纖維蛋白凝塊作用原理圖Fig.2 Schematic diagram of role of fibrin clot formation in microcapsule

圖3 溶膠-凝膠法制備SiO2基體原理圖Fig.3 Schematic diagram of sol-gel process to prepare SiO2matrix

人工合成有機高分子材料用于人工細胞的可行性研究已成為目前研究的熱點.如用戊二醛為交聯(lián)劑，陽離子交換樹脂D151制備乳糖酶人工細胞，以及聚苯乙烯陰離子交換樹脂吸附交聯(lián)法合成α-淀粉酶人工細胞等.俞宏峰等［34］采用樹脂吸附—海藻酸鈣包埋—戊二醛交聯(lián)法制備乳糖酶人工細胞，分11批次反應后，乳糖水解率保持在85%，連續(xù)反應62天水解率仍然保持在80%，這種方法制成的乳糖酶人工細胞具有優(yōu)越的操作性能.

3 人工細胞的制備方法

人工細胞的劃分除了以上按制備原料分類外，還可以按照人工細胞的制備方法進行劃分.目前，大致可以將其分為3類：固定化酶法，用于制備具有某種特定功能的人工細胞；遺傳信息表達法，構建能夠進行自我復制的人工細胞；構造通透性膜法，通過改進膜材料改善膜的通透性.以下將對這3種人工細胞進行簡單的介紹.

當“共享型人力資源”與“創(chuàng)業(yè)型企業(yè)”實現(xiàn)結合，如何實現(xiàn)“可持續(xù)發(fā)展”就成為企業(yè)發(fā)展的關鍵?？沙掷m(xù)發(fā)展是一種注重長遠發(fā)展的經(jīng)濟增長模式，最初于1972年提出，指既滿足當代人的需求，又不損害后代人滿足其需求的發(fā)展，是科學發(fā)展觀的基本要求之一。而企業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，其主體關注的是企業(yè)是否能一直延續(xù)發(fā)展下去，而且要符合企業(yè)自身、企業(yè)外部乃至整個社會的發(fā)展要求。“共享型人力資源”為企業(yè)發(fā)展提供了前進的不竭動力，“創(chuàng)業(yè)型企業(yè)”目標為企業(yè)發(fā)展提供了前進的方向，而“可持續(xù)發(fā)展”則為企業(yè)的前進提供了先進的理念。

3.1 固定化酶法

酶是生命體生命活動不可或缺的生物催化劑，細胞中各種酶的協(xié)同催化作用使得細胞的各種功能得以順利進行.因此，制備負載有酶的人工細胞微囊具有重要研究意義.人工細胞在固定化酶方面的應用最為廣泛.在這里，我們首先對固定化酶進行介紹.

3.1.1 固定化酶的提出

游離酶的穩(wěn)定性較差，活性受pH值及溫度的影響比較明顯，且在水溶液中，反應物及產(chǎn)物較難分離，從而使酶的使用成本增加，限制了酶的廣泛應用.

為解決上述問題，從20世紀60年代開始，酶的固定化技術漸漸發(fā)展起來，酶的固定化既能保持酶的催化活性又能克服游離酶的一些不足，使酶分子結構的穩(wěn)定性增加，耐酸、耐堿性增強，重復使用性增加，且反應后易與產(chǎn)物分離.不僅有效地控制了生產(chǎn)過程，又簡化了生產(chǎn)工藝.因此固定化酶技術成為了酶工程中的研究熱點［35］.如2004年，Luckarift等［36］用仿生硅化法固定化酶取得了良好的成果.他們將一定比例的R5多肽、TMOS水解液和丁酰膽堿酯酶進行混合，在多肽的催化作用下成功包埋了丁酰膽堿酯酶的R5/氧化硅納米顆粒，在納米顆粒中丁酰膽堿酯酶的活性維持率幾乎達到100%.

3.1.2 固定化酶的方法

酶的固定化方法大致可以分為4類，即吸附法、共價結合法、交聯(lián)法和包埋法［37-38］，如圖4所示.

圖4 固定化酶方法Fig.4 Enzyme immobilisation strategies

（1）包埋法：將酶分子截留在具有特定網(wǎng)狀結構載體中的一種固定化方法.可分為凝膠包埋法、纖維包埋法、半透膜包埋法和輻射包埋法.常用的包埋載體有天然高分子，如海藻酸鈉、瓊脂糖等，以及合成高分子，如聚乙烯醇（PVA）、聚丙烯酰胺凝膠等.包埋法具有廣泛的適用性，因為它僅僅只是將酶分子進行包埋，未進行化學修飾，所以酶活性較高，且避免了酶和外界環(huán)境的直接接觸.但此方法不適用于作用大分子底物或產(chǎn)物的酶的固定化［38］.

（2）微囊封裝法：用半透性的聚合物膜封裝酶分子，從而形成一種微膠囊型的固定化酶.

（3）吸附法：酶分子通過氫鍵、離子鍵等吸附于不溶于水的載體表面的方法.可以分為物理吸附和離子吸附.常用的載體有纖維素、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等.吸附法操作簡便，但實際應用中易受到pH、鹽離子濃度的影響而脫落.

（4）交聯(lián)法：在酶分子之間或酶分子與載體間利用雙功能或多功能試劑形成凝集的網(wǎng)狀結構的固定化方法.這種方法成本低，操作簡便且形成的孔徑較大，容易實現(xiàn)多種催化劑的共交聯(lián)；但固定化過程中條件難以控制，酶的回收率較低，機械強度較差.

共價結合法：酶分子與載體通過共價鍵形成不可逆的連接.常用的載體有纖維素、殼聚糖、葡聚糖等.這種方法固定化的酶與載體結合穩(wěn)定，但制備過程較為復雜，且酶活性可能不高.

3.1.3 多酶共固定

在生物細胞中，往往需要多種酶的協(xié)同作用來維持生命體的正常功能.同樣，在工業(yè)應用中，常常也需要多種酶的一系列作用生產(chǎn)某種產(chǎn)品.多酶共固定化就是將多種酶固定在同一載體上，各種酶的特點充分發(fā)揮且相互聯(lián)系，使細胞微囊具備特定功能的固定化酶的方法.南開大學史林啟課題組［6］研制出一種可以降解血液中酒精含量的人工細胞，他們將醇氧化酶和過氧化氫酶形成的酶納米復合物封裝在一個薄的聚合物殼內形成細胞微囊，兩種酶的協(xié)同作用避免了有毒代謝產(chǎn)物的積累，將這種人工細胞可以明顯降低酒精中毒小鼠體內血液中酒精的含量.Brigitte等［39］研究了用層層自組裝法構造的人工細胞和細胞器的結構，這種合成單元為新一代治療運載工具的發(fā)展提供了強大的生物醫(yī)藥平臺.如圖5所示，即是層層自組裝及其去核過程.圖5中：（i）結構骨架為具有半透性的聚合物水凝膠膜，實現(xiàn)膜內與外部環(huán)境之間營養(yǎng)物質的交換；（ii）包埋酶分子后LbL模仿溶酶體引發(fā)DNA的降解；（iii）用一層合并的脂質體骨架與囊泡內部隔開.

圖5 源于LBL微囊的模擬細胞和細胞器的結構示意圖Fig.5 Schematic diagram of simulated cell and organelle derived from LBL microcapsules

通常，要在微囊中進行空間的劃分來有順序的放置不同的酶（即所謂的分區(qū)）.例如，按照酶的反應次序進行分區(qū).通過分區(qū)可以實現(xiàn)對化學反應的控制，使細胞在反應中不被破壞，或者利用空間組合實現(xiàn)多步的串聯(lián)反應，從而使一系列的反應可以有序進行.一般在雙層膜微囊的3個不同位置包埋不同的酶.如在嵌段共聚物（isocyanopeptides）和苯乙烯形成的多孔共聚物囊泡的內腔、雙層膜上和表面分別包埋葡萄糖氧化酶（glucose oxidase），脂肪酶（Candida antarctica lipase B）和辣根過氧化酶（horseradish peroxidase）3種酶［40］.如圖6所示，PS-PIAT和anchor 1的混合物與CalB酶冷凍干燥后溶解于THF中，而后將其注入到含GOx酶的緩沖液中，共聚物膜上封裝誘捕的CalB酶，在膜表面通過共價鍵固定HRP酶.目前，對于這種復雜酶系統(tǒng)模擬的工作重點主要集中在酶的包埋和組裝［34-35，41-43］.

天津大學Jiang等［44-45］利用仿生鈦化方法制備出一種新型Alg-Pro-Ti雜化微囊，在其中固定多種酶作為微工廠廠房，利用LbL微囊作為工作車間，實現(xiàn)了多酶體系內部的功能分割.建立形成的這種“仿生微工廠”具備6種機制，分別為：結構外殼或支架，生物分子與環(huán)境之間的交流運輸，感應機制，酶的封裝，靶向和細胞做出響應［46］，具體結構如圖7所示.

圖6 共聚物囊泡中HRP，CalB，GOx的包埋位置Fig.6 Self-Assembly of HRP，CalB，Gox in a polymersome

圖7 “仿生微工廠”結構示意圖Fig.7 Schematic diagram of Bionic microfactory

3.2 遺傳信息表達法

生命體細胞無時無刻不在進行著遺傳信息的表達過程，通過細胞的分裂實現(xiàn)遺傳信息的傳遞.近年來，學者們致力于研究可以實現(xiàn)遺傳物質自我復制的人工細胞.

東京大學的Kurihara等［5］研制出了一種可以實現(xiàn)DNA擴增（PCR）、能自我復制的人工細胞.通過聚陰離子的DNA和陽離子細胞膜的相互作用，將信息物質的自我復制與人工細胞的自我復制連接起來，擴增后的DNA能平均分配到子代細胞內且DNA的擴增加速了人工細胞的分裂.具體過程如圖8所示，

DNA的擴增過程中，在含有模板DNA、引物、熒光標記的SYBR GreenⅠ、脫氧核苷三磷酸、DNA聚合酶和Mg2+的緩沖溶液中用薄膜溶脹法制備含有PCR試劑的GVS水分散液；微囊的自我復制過程中，膜前體物質的加入誘導微囊進行自我復制，擴增DNA的附著加速了囊泡的生長和分裂.但是，細胞的自我復制是有限度的.因為隨著細胞分離，磷脂質所占百分比的降低，陽離子人工膜含量不斷增加.

圖8 DNA的擴增及人工細胞自我復制圖Fig.8 Schematic diagram of amplification of DNA and self-reproduction of GVs

Pierre-Alain等［16］將T7 RNA聚合酶和DNA模板包裹在脂質囊泡（脂質體）中，發(fā)現(xiàn)包埋后脂質體膜有足夠的滲透性，可以允許和三磷酸腺苷（NTPs）一樣大的離子化底物分子通過并與酶接觸.包埋的聚合酶利用堿基序列轉錄特定的DNA模板合成核糖核酸RNA，其原理如圖9所示.圖中：a（i）23.3℃時，NTPs通過被動運輸?shù)姆绞酵高^脂質體膜；a（ii）37℃時，酶的活性最佳但NTPs的擴散能力較差；b脂質體內NTPs（虛線）的濃度和RNA的形成（實線）遵循溫度變化形成循環(huán)：溫度為23.3℃時，NTPs大量積聚；37℃時，NTPs用于轉錄模板RNA被迅速耗盡.他們的研究表明了在單個隔室中遺傳信息單元可以與功能催化劑相關聯(lián)，基因大小的DNA片段的轉錄可以僅僅靠被動擴散供給的NTPs基質來實現(xiàn).

圖9 T7 RNA聚合酶脂質體系統(tǒng)原理圖Fig.9 Schematic diagram of T7 RNApolymerase liposomal system

將脫細胞的大腸桿菌封裝在磷脂囊泡中建立一個類細胞的生物反應器表達系統(tǒng).用乳液法將大腸桿菌提取物、綠色熒光蛋白基因包埋在大的單層脂質體中，而后將形成的雙層微囊放置于含有核苷酸和氨基酸的溶液里進行培養(yǎng)（基因的轉錄和翻譯是分開進行的），檢測到綠色熒光蛋白基因的表達在2 h后停止，但若同時將α-溶血素包埋在囊泡里，綠色熒光蛋白的表達時間可以持續(xù)4 d［18］.

3.3 構造通透性細胞膜法

生命體中的磷脂細胞膜對穿過細胞膜的極性帶電分子具有很強的阻礙作用，這種作用使得人們很難了解細胞生命的起源.因此，制備人工細胞時，就需要細胞膜能夠具有復雜的蛋白通道和離子泵來調解細胞與外界環(huán)境之間的物質交換.

在生命體細胞中，存在著一種光驅動離子泵BR（Bacteriorhodopsin），它能夠維持細胞膜內外物質的濃度差，這種濃度差可以驅動F0F1-ATP合成酶合成ATP.將BR及F0F1-ATP合成酶包埋于脂質體中，光照條件下，人工細胞也可以合成ATP［47］，合成過程如圖10所示.

圖10 包含BR和F0F1-ATP合成酶的脂質體合成ATP示意圖Fig.10 Schematic diagram of synthesis of ATP that liposomes containing BR and F0F1-ATP synthase

二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿（DMPC）細胞膜在凝膠—液體的轉變溫度下會存在缺陷，核苷酸可以利用這種缺陷穿過細胞膜，但是這種膜本身不具備膜生長的動態(tài)特性，所以在應用中受到限制.Mansy等［4］提出用脂肪酸及其醇類和甘油單酯來制備人工細胞膜，因為它們是形成細胞雙分子層的簡單兩親化合物，可以使封裝在其中的寡核苷酸保持生長和分裂的能力.他們已經(jīng)證實了這種人工細胞膜可允許帶電分子的通過，如將激活的核苷酸加入到細胞膜外，它可以自發(fā)的穿過細胞膜并在細胞內部參與遺傳信息的復制且完整遺傳物質的分裂促進了子代人工細胞的形成.如圖11所示為其理論模型.

圖11 核苷酸自發(fā)通過人工細胞膜并參與復制的概念模型Fig.11 Conceptual model of nucleotides spontaneously permeate across the artificial cell membrane and act as substrates in replication

4 結語

目前，學者們對人工細胞在組織工程、藥物負載甚至催化化學領域的應用都已展開研究.例如，微囊化胰島細胞應用于治療糖尿病，改善糖代謝異常問題，且能降低免疫排斥反應；微囊化人工細胞負載抗癌藥物移植入小鼠體內取得較好的治療效果；在催化化學領域，利用在人工細胞中固定酸脫氫酶、醛脫氫酶和醇脫氫酶三種酶做為催化劑，將二氧化碳轉化為甲醇［48］.

但是，種種制約因素導致人工細胞的應用目前大多還只是在實驗階段.例如，固定化酶法制備人工細胞時微囊材料就是首要影響因素.酶固定化要求載體材料要有良好的機械強度、熱穩(wěn)定性、化學穩(wěn)定性、抗微生物特性及酶的結合能力等.由于尋找理想人工細胞材料困難，酶在固定化過程中不可避免地會損失部分活力，甚至當固定方法不得當時會損失絕大部分活力等原因，到目前為止也只有十幾種固定化酶被應用于生產(chǎn)中.此外，制備材料的價格也是直接影響人工細胞能否廣泛應用的重要因素.

人工細胞的制備涉及醫(yī)學、生物學、化學、高分子材料學等多種學科的交叉結合.所以，要想制備出具有特定功能且性能優(yōu)良的人工細胞必然需要多種學科的共同協(xié)作.近年來，人們利用接枝改性等方法創(chuàng)造著不同種類人工細胞，但要真正達到向生命體細胞那樣能自我復制、自我修復和進化、選擇透過性好的人工細胞，還需要各界學者的進一步研究.

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Review on research process of artificial cells preparation

LIU Wei1，2，LI Pei-sen1，2，LI Ke2，WU Xin2
（1.State Key Laboratory of Separation Membranes and Membrane Process，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300387，China；2.School of Environmental and Chemical Engineering，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300387，China）

Artificial cells are cell-like microcapsules with functions similar to the living cells，mimicking the dedicated structures of biological cells，such as encapsulate biological macromolecules in microcapsules to achieve specific functions or to find new materials for the preparation of the cell membrane with felicitous permeability，etc.The development and application of artificial cells in recent decades are briefly overviewed from the point of view of chemical and biological prospective.The current difficulties and future research directions for the development of artificial cells are also discussed.

artificial cell；preparation method；microcapsule；immobilized enzyme；multienzyme immobilization；carriers

O631；R318

A

1671-024X（2016）05-0011-09

10.3969/j.issn.1671-024x.2016.05.003

2016-03-14

國家自然科學基金資助項目（21504063）；天津市自然科學基金一般項目（12JCYBJC32000）；天津市科技計劃項目（15PTSYJC00230）

劉 ?。?981—），女，博士，講師，主要研究方向為高分子材料.E-mail：liuhuiwen217@yahoo.com